Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Descrevemos um procedimento fácil para a complementação cromossômica de cópia única de um gene de bomba de efluxo usando um sistema de expressão baseado em mini-Tn7 em uma cepa deficiente em efluxo projetada de Acinetobacter baumannii. Esta ferramenta genética precisa permite a expressão gênica controlada, o que é fundamental para a caracterização de bombas de efluxo em patógenos multirresistentes.

Abstract

Acinetobacter baumannii é reconhecido como um patógeno Gram-negativo desafiador devido à sua ampla resistência a antibióticos. É crucial compreender os mecanismos por trás dessa resistência para desenhar novas e eficazes opções terapêuticas. Infelizmente, nossa capacidade de investigar esses mecanismos em A. baumannii é prejudicada pela escassez de ferramentas adequadas de manipulação genética. Aqui, descrevemos métodos para utilizar um sistema cromossômico baseado em mini-Tn7 para obter expressão gênica de cópia única em uma cepa de A. baumannii que não possui mecanismos funcionais de efluxo do tipo RND. A inserção de cópia única e a expressão de bomba de efluxo induzível são bastante vantajosas, pois a presença de operons de efluxo de RND em plasmídeos de alto número de cópias é frequentemente mal tolerada pelas células bacterianas. Além disso, a incorporação de vetores de expressão recombinante de mini-Tn7 no cromossomo de um hospedeiro substituto de A. baumannii com sensibilidade aumentada ao efluxo ajuda a contornar a interferência de outras bombas de efluxo. Este sistema é valioso não apenas para investigar bombas de efluxo bacteriano não caracterizadas, mas também para avaliar a eficácia de potenciais inibidores direcionados a essas bombas.

Introduction

Acinetobacter baumannii é um patógeno prioritário da Organização Mundial da Saúde devido à sua resistência abrangente a todas as classes de antibióticos1. É um patógeno oportunista que afeta principalmente pessoas hospitalizadas, feridas ou imunocomprometidas. A. baumannii evade amplamente antibióticos através de bombas de efluxo, sendo a mais relevante a família de exportadores Resistance-Nodulation-Division (RND)2. Entender como essas bombas de efluxo funcionam mecanisticamente permitirá desenvolver opções terapêuticas direcionadas.

Uma maneira comum de distinguir ....

Protocol

1. Preparação experimental

  1. Purificar o plasmídeo pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9 (plasmídeo de inserção, Figura 2A) com o gene de interesse.
    NOTA: Aqui, o gene de interesse é adeIJK. A concentração final do plasmídeo deve ser de ≥100 ng/μL.
  2. Purificar o plasmídeo auxiliar (pTNS2)9 e o plasmídeo de excisão (pFLP2ab)6 (Figura 2B,C

Representative Results

O procedimento de inserção cromossômica leva apenas 2 h no total ao longo de 3 dias para ver um resultado-colônias crescendo em uma placa de ágar seletiva (Figura 1A-C). O número esperado de colônias na placa de transformação é dependente da deformação: pode-se ver 20-30 ou mesmo centenas de colônias, pois a inserção de Tn7 nos sítios attTn7 é específica eeficiente9. O patch das colônias da placa de transfo.......

Discussion

Embora este procedimento para a inserção cromossômica de um sistema induzível de expressão gênica de cópia única em A. baumannii seja tecnicamente simples e não trabalhoso, existem alguns passos importantes que precisam ser enfatizados. Primeiro, a preparação das células competentes precisa ser feita em gelo, tanto quanto possível, pois as células se tornam frágeis durante a substituição do meio por água gelada. Idealmente, as etapas de centrifugação são realizadas a 4 °C, mas a centrifuga?.......

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por uma Bolsa de Descoberta do Conselho de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá para AK. Os esquemas utilizados nas figuras são criados com BioRender.com.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL PCR tubeVWR20170-012For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubesSarstedt72-690-301General use
13-mL culture tubes, PyrexFisher14-957KLiquid culture vessels
6x DNA loading bufferFroggabioLD010Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacialFisher351271-212Agarose gel running buffer component
AgarBioshopAGR003Solid growth media
AgaroseBioBasicD0012Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unitFisher29-237-54Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
CarbenicillinFisher50841231Selective media
Culture tube closuresFisher13-684-138Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) setBiobasicDD0058PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heaterFisher88860023Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettesVWR89047-2082 mm electroporation cuvettes with round cap
ElectroporatorCole Parmer940000009110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromideFisherBP102-1Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)VWRCA-EM4050Agarose gel running buffer component
GentamicinBiobasicGB0217For the preparation of selective media
GlycerolFisherG33Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking)New Brunswick ScientificM1352-0000Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static)Fisher11-690-550DIsotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loopSarstedt86.1562.050Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreaderSarstedt86.1569.005Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, LennoxFisherBP1427Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
MicrofugeFisher75002431Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifugeFisherS67601BCentrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishesSPL Life Sciences10090For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes MandelVariousGilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supplyBiorad1645050PowerPac Basic power supply for electrophoresis
PrimersIDTNAPCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
SucroseBioBasicSB0498For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymeraseFroggaBioT-500PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cyclerBiorad1861096Model T100 for PCR
ToothpicksFisherS24559For patching colonies onto agar plates
Trizma baseSigmaT1503Agarose gel running buffer component
Ultrapure waterMillipore SigmaZLXLSD51040MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA markerBiobasicM103R-2Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticksFisher29-801-02Inoculating cultures with colonies from agar plates

References

  1. Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017)
  2. Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp.

Explore More Articles

Imunologia e Infec oEdi o 203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved