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Descrevemos um procedimento fácil para a complementação cromossômica de cópia única de um gene de bomba de efluxo usando um sistema de expressão baseado em mini-Tn7 em uma cepa deficiente em efluxo projetada de Acinetobacter baumannii. Esta ferramenta genética precisa permite a expressão gênica controlada, o que é fundamental para a caracterização de bombas de efluxo em patógenos multirresistentes.
Acinetobacter baumannii é reconhecido como um patógeno Gram-negativo desafiador devido à sua ampla resistência a antibióticos. É crucial compreender os mecanismos por trás dessa resistência para desenhar novas e eficazes opções terapêuticas. Infelizmente, nossa capacidade de investigar esses mecanismos em A. baumannii é prejudicada pela escassez de ferramentas adequadas de manipulação genética. Aqui, descrevemos métodos para utilizar um sistema cromossômico baseado em mini-Tn7 para obter expressão gênica de cópia única em uma cepa de A. baumannii que não possui mecanismos funcionais de efluxo do tipo RND. A inserção de cópia única e a expressão de bomba de efluxo induzível são bastante vantajosas, pois a presença de operons de efluxo de RND em plasmídeos de alto número de cópias é frequentemente mal tolerada pelas células bacterianas. Além disso, a incorporação de vetores de expressão recombinante de mini-Tn7 no cromossomo de um hospedeiro substituto de A. baumannii com sensibilidade aumentada ao efluxo ajuda a contornar a interferência de outras bombas de efluxo. Este sistema é valioso não apenas para investigar bombas de efluxo bacteriano não caracterizadas, mas também para avaliar a eficácia de potenciais inibidores direcionados a essas bombas.
Acinetobacter baumannii é um patógeno prioritário da Organização Mundial da Saúde devido à sua resistência abrangente a todas as classes de antibióticos1. É um patógeno oportunista que afeta principalmente pessoas hospitalizadas, feridas ou imunocomprometidas. A. baumannii evade amplamente antibióticos através de bombas de efluxo, sendo a mais relevante a família de exportadores Resistance-Nodulation-Division (RND)2. Entender como essas bombas de efluxo funcionam mecanisticamente permitirá desenvolver opções terapêuticas direcionadas.
Uma maneira comum de distinguir ....
1. Preparação experimental
O procedimento de inserção cromossômica leva apenas 2 h no total ao longo de 3 dias para ver um resultado-colônias crescendo em uma placa de ágar seletiva (Figura 1A-C). O número esperado de colônias na placa de transformação é dependente da deformação: pode-se ver 20-30 ou mesmo centenas de colônias, pois a inserção de Tn7 nos sítios attTn7 é específica eeficiente9. O patch das colônias da placa de transfo.......
Embora este procedimento para a inserção cromossômica de um sistema induzível de expressão gênica de cópia única em A. baumannii seja tecnicamente simples e não trabalhoso, existem alguns passos importantes que precisam ser enfatizados. Primeiro, a preparação das células competentes precisa ser feita em gelo, tanto quanto possível, pois as células se tornam frágeis durante a substituição do meio por água gelada. Idealmente, as etapas de centrifugação são realizadas a 4 °C, mas a centrifuga?.......
Os autores não têm nada a revelar.
Este trabalho foi apoiado por uma Bolsa de Descoberta do Conselho de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá para AK. Os esquemas utilizados nas figuras são criados com BioRender.com.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 mL PCR tube | VWR | 20170-012 | For colony boil preparations and PCR reactions |
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72-690-301 | General use |
13-mL culture tubes, Pyrex | Fisher | 14-957K | Liquid culture vessels |
6x DNA loading buffer | Froggabio | LD010 | Agarose gel electrophoresis sample loading dye |
Acetic acid, glacial | Fisher | 351271-212 | Agarose gel running buffer component |
Agar | Bioshop | AGR003 | Solid growth media |
Agarose | BioBasic | D0012 | Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2% |
Agarose gel electrophoresis unit | Fisher | 29-237-54 | Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products |
Carbenicillin | Fisher | 50841231 | Selective media |
Culture tube closures | Fisher | 13-684-138 | Stainless steel closure for 13-mL culture tubes |
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set | Biobasic | DD0058 | PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP |
Dry bath/block heater | Fisher | 88860023 | Isotemp digital dry bath for boil preparations |
Electroporation cuvettes | VWR | 89047-208 | 2 mm electroporation cuvettes with round cap |
Electroporator | Cole Parmer | 940000009 | 110 VAC, 60 Hz electroporator |
Ethidium bromide | Fisher | BP102-1 | Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR | CA-EM4050 | Agarose gel running buffer component |
Gentamicin | Biobasic | GB0217 | For the preparation of selective media |
Glycerol | Fisher | G33 | Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer |
Incubator (shaking) | New Brunswick Scientific | M1352-0000 | Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth |
Incubator (static) | Fisher | 11-690-550D | Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth |
Inoculation loop | Sarstedt | 86.1562.050 | Streaking colonies onto agar plates |
Inoculation spreader | Sarstedt | 86.1569.005 | Spreading of culture onto agar plates |
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox | Fisher | BP1427 | Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract) |
Microfuge | Fisher | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples |
Mini-centrifuge | Fisher | S67601B | Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes |
Petri dishes | SPL Life Sciences | 10090 | For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm |
Pipettes | Mandel | Various | Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
Power supply | Biorad | 1645050 | PowerPac Basic power supply for electrophoresis |
Primers | IDT | NA | PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet |
Sucrose | BioBasic | SB0498 | For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii |
Taq DNA polymerase | FroggaBio | T-500 | PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer |
Thermal cycler | Biorad | 1861096 | Model T100 for PCR |
Toothpicks | Fisher | S24559 | For patching colonies onto agar plates |
Trizma base | Sigma | T1503 | Agarose gel running buffer component |
Ultrapure water | Millipore Sigma | ZLXLSD51040 | MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing |
Wide range DNA marker | Biobasic | M103R-2 | Size determination of PCR products on an agarose gel |
Wooden inoculating sticks | Fisher | 29-801-02 | Inoculating cultures with colonies from agar plates |
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