Caracterização de Sistemas de Efluxo Multidrogas em Acinetobacter baumannii Usando uma Cepa Bacteriana Deficiente em Efluxo e um Sistema de Expressão Gênica de Cópia Única

Summary

Descrevemos um procedimento fácil para a complementação cromossômica de cópia única de um gene de bomba de efluxo usando um sistema de expressão baseado em mini-Tn7 em uma cepa deficiente em efluxo projetada de Acinetobacter baumannii. Esta ferramenta genética precisa permite a expressão gênica controlada, o que é fundamental para a caracterização de bombas de efluxo em patógenos multirresistentes.

Abstract

Acinetobacter baumannii é reconhecido como um patógeno Gram-negativo desafiador devido à sua ampla resistência a antibióticos. É crucial compreender os mecanismos por trás dessa resistência para desenhar novas e eficazes opções terapêuticas. Infelizmente, nossa capacidade de investigar esses mecanismos em A. baumannii é prejudicada pela escassez de ferramentas adequadas de manipulação genética. Aqui, descrevemos métodos para utilizar um sistema cromossômico baseado em mini-Tn7 para obter expressão gênica de cópia única em uma cepa de A. baumannii que não possui mecanismos funcionais de efluxo do tipo RND. A inserção de cópia única e a expressão de bomba de efluxo induzível são bastante vantajosas, pois a presença de operons de efluxo de RND em plasmídeos de alto número de cópias é frequentemente mal tolerada pelas células bacterianas. Além disso, a incorporação de vetores de expressão recombinante de mini-Tn7 no cromossomo de um hospedeiro substituto de A. baumannii com sensibilidade aumentada ao efluxo ajuda a contornar a interferência de outras bombas de efluxo. Este sistema é valioso não apenas para investigar bombas de efluxo bacteriano não caracterizadas, mas também para avaliar a eficácia de potenciais inibidores direcionados a essas bombas.

Introduction

Acinetobacter baumannii é um patógeno prioritário da Organização Mundial da Saúde devido à sua resistência abrangente a todas as classes de antibióticos¹. É um patógeno oportunista que afeta principalmente pessoas hospitalizadas, feridas ou imunocomprometidas. A. baumannii evade amplamente antibióticos através de bombas de efluxo, sendo a mais relevante a família de exportadores Resistance-Nodulation-Division (RND)². Entender como essas bombas de efluxo funcionam mecanisticamente permitirá desenvolver opções terapêuticas direcionadas.

Uma maneira comum de distinguir ....

Protocol

1. Preparação experimental

1. Purificar o plasmídeo pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (plasmídeo de inserção, Figura 2A) com o gene de interesse.
   NOTA: Aqui, o gene de interesse é adeIJK. A concentração final do plasmídeo deve ser de ≥100 ng/μL.
2. Purificar o plasmídeo auxiliar (pTNS2)⁹ e o plasmídeo de excisão (pFLP2^ab)⁶ (Figura 2B,C

Discussion

Embora este procedimento para a inserção cromossômica de um sistema induzível de expressão gênica de cópia única em A. baumannii seja tecnicamente simples e não trabalhoso, existem alguns passos importantes que precisam ser enfatizados. Primeiro, a preparação das células competentes precisa ser feita em gelo, tanto quanto possível, pois as células se tornam frágeis durante a substituição do meio por água gelada. Idealmente, as etapas de centrifugação são realizadas a 4 °C, mas a centrifuga?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tube	VWR	20170-012	For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72-690-301	General use
13-mL culture tubes, Pyrex	Fisher	14-957K	Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer	Froggabio	LD010	Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial	Fisher	351271-212	Agarose gel running buffer component
Agar	Bioshop	AGR003	Solid growth media
Agarose	BioBasic	D0012	Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit	Fisher	29-237-54	Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin	Fisher	50841231	Selective media
Culture tube closures	Fisher	13-684-138	Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set	Biobasic	DD0058	PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater	Fisher	88860023	Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes	VWR	89047-208	2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide	Fisher	BP102-1	Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agarose gel running buffer component
Gentamicin	Biobasic	GB0217	For the preparation of selective media
Glycerol	Fisher	G33	Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop	Sarstedt	86.1562.050	Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader	Sarstedt	86.1569.005	Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox	Fisher	BP1427	Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge	Fisher	S67601B	Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes	SPL Life Sciences	10090	For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes	Mandel	Various	Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply	Biorad	1645050	PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers	IDT	NA	PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose	BioBasic	SB0498	For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase	FroggaBio	T-500	PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
Toothpicks	Fisher	S24559	For patching colonies onto agar plates
Trizma base	Sigma	T1503	Agarose gel running buffer component
Ultrapure water	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker	Biobasic	M103R-2	Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks	Fisher	29-801-02	Inoculating cultures with colonies from agar plates