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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

In questo articolo, forniamo una procedura pratica per la dissezione e l'esecuzione di analisi istologiche e di espressione genica del tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino.

Abstract

La termogenesi mediata dal tessuto adiposo bruno (BAT) svolge un ruolo importante nella regolazione del metabolismo e la sua morfologia e funzione possono essere notevolmente influenzate dagli stimoli ambientali nei topi e nell'uomo. Attualmente, il BAT interscapolare murino (iBAT), che si trova tra due scapole nel fianco dorsale superiore dei topi, è il principale deposito di BAT utilizzato dai laboratori di ricerca per studiare la funzione dei BAT. Recentemente, sono stati identificati alcuni depositi BAT precedentemente sconosciuti nei topi, tra cui uno analogo al tessuto adiposo bruno sopraclavicolare umano. A differenza dell'iBAT, il tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino (scBAT) si trova nello strato intermedio del collo e quindi non è facilmente accessibile.

Per facilitare lo studio di scBAT murini appena identificati, viene presentato un protocollo che descrive in dettaglio i passaggi per sezionare scBAT intatti da topi postnatali e adulti. A causa delle piccole dimensioni di scBAT rispetto ad altri depositi adiposi, le procedure sono state modificate e ottimizzate specificamente per il trattamento di scBAT. Tra queste modifiche c'è l'uso di un microscopio da dissezione durante la raccolta dei tessuti per aumentare la precisione e l'omogeneizzazione dei campioni scBAT congelati per aumentare l'efficienza della successiva analisi qPCR. Con queste ottimizzazioni, è possibile determinare l'identificazione, l'aspetto morfologico e la caratterizzazione molecolare dello scBAT nei topi.

Introduction

La crescente prevalenza dell'obesità negli Stati Uniti e in tutto il mondo ha suscitato un grande interesse per la comprensione della sua eziologia e l'identificazione di potenziali trattamenti 1,2. Il tessuto adiposo svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo e la disregolazione del tessuto adiposo può portare allo sviluppo dell'obesità. Generalmente, esistono due tipi di tessuto adiposo, il tessuto adiposo bianco e il tessuto adiposo bruno. Mentre il tessuto adiposo bianco (WAT) può immagazzinare energia chimica e secernere fattori endocrini, il tessuto adiposo bruno (BAT) può utilizzare l'energia chimica ....

Protocol

Le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso il Baylor College of Medicine. Tutte le procedure sono state eseguite su topi maschi C57BL/6J di età compresa tra 3 settimane e 3 mesi. Prima della dissezione, tutti i topi sono stati sottoposti a eutanasia utilizzando la procedura approvata per l'eutanasia dell'anidride carbonica dei roditori. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo .......

Representative Results

A differenza dell'iBAT, che si trova nello strato sottocutaneo della schiena tra due scapole, lo scBAT è situato nello strato intermedio del collo, che si estende in profondità tra gli strati del muscolo scheletrico e della ghiandola salivare mentre cresce lungo la vena giugulare esterna (Figura 1A). L'analisi di scBAT non è così semplice come iBAT. Qui, forniamo una procedura dettagliata che include passaggi cruciali per la dissezione di scBAT intatti da.......

Discussion

In questo protocollo, presentiamo in dettaglio le procedure per la dissezione e l'elaborazione di scBAT per l'analisi di H&E e di espressione genica. Poiché lo scBAT risiede nello strato intermedio del collo e si trova lungo le grandi vene, l'isolamento di questo deposito richiede una tecnica precisa. In particolare, per ottenere una visione chiara del deposito, si consiglia di posizionare il topo sotto un microscopio da dissezione dopo l'apertura del collo. Utilizzando un paio di pinze a punta superfine per staccare lo.......

Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgements

Questo lavoro è supportato dal NIDDK del NIH con il numero di premio R01DK116899, dall'USDA/ARS con il numero di premio 3092-51000-064-000D e da un premio pilota del Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute. I diagrammi di flusso sono stati prodotti utilizzando BioRender.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
95% Dehydrant Alcohol (Flex 95)Epredia8201
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100)Epredia8101
96-well PCR plateBio-RadMLL9601
Aurum Binding Mini ColumnBio-Rad7326826
Aurum High Stringency WashBio-Rad7326803
Aurum Low Stringency WashBio-Rad7326804
Base Molds (for embedding)Tissue-Tek4122
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2"Becton Dickinson305167
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad1840148
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mLFisherbrand02-681-453
Centrifuge Eppendorf5430R
CFX Opus 96 Real-Time PCR InstrumentBio-Rad12011319
ChloroformThermo Scientific Chemicals383760010
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting mediumEpredia83104
DEPC-Treated WaterAmbionAM 9906
Dissecting MicroscopeNikonSMZ1500
DNase Dilution SolutionBio-Rad7326805
DNase IBio-Rad7326828
dNTPsInvitrogen18427013
Elution solutionBio-Rad7326801
EM 400 embedding medium paraffinLeica Biosystems3801320
Eosin Y (0.5% w/v)RICCA2858-16
Formula R Infiltration medium paraffinLeica Biosystems3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349Bio ExpressS-3200-2
Gill #3 HematoxylinSigma-AldrichGHS332-1L
HCl (for HCL-Ethanol)Fisher ChemicalA142212
IP VI Embedding CassettesLeica Biosystems39LC-550-5-L
Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol)Decon LabsV1001
MgCl2 (25 mM)Thermo Fisher ScientificR0971
Microcentrifuge Tubes 1.7 mLAvantor87003-294
Microseal 'B' Seals (adhseive seals)Bio-RadMSB1001
MicrotomeLeica BiosystemsRM2245
Molecular Biology Grade WaterCorning46-000-CM
Mortar Coors TekThomas Scientific60310
NaCl (for 0.85% saline)Fisher BioreagentsBP358-212
NanoDrop SpectrophotometerNanoDrop TechnologiesND-1000 UV/Vis
Oligo dTInvitrogen18418020
Paraffin Section Flotation BathBoekel Scientific14792V
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-AldrichP6148-500G
PCR Tube StripAvantor76318-802
Pestle by Coors TekThomas Scientific60311
Pestle Pellet MotorKimble749540-0000
Phosphate Buffer Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
Precision Model 19 Vacuum Oven Thermo Fisher ScientificCAT# 51221162
Primer: 36B4  (forward) 10 μM
5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’
Chen lab Oligo database
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM
5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM
5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM
5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM
5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM
5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’
Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (forward) 10 μM
5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’
Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (reserve) 10 μM
5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM
5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM
5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM
5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM
5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’
Chen lab Oligo database
RNA isolation solution (PureZol)Bio-Rad7326880
RNase Away (surface decontaminant)Thermo Scientific1437535
RNase HNEBM0297S
Rnase inhibitor (RNase Out)Invitrogen10777019
Scintillation Vial (glass)Electron Microscopy Sciences72632
Slide drying bench Electrothermal (Cole-Parmer)MH6616
Stainless staining rackElectron Microscopy Sciences70312-54
Stereo microscope (for embedding)OlympusSZ51
Sugical scissorsMcKesson43-1-104
Superfine point Straight Dissecting ForcepsAvantor82027-402
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) Invitrogen18080044
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mLTerumo100281
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture)Applied BiosystemsA25778
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars)Electron Microscopy SciencesSKU: 62540-01
TolueneFisher ChemicalT324-1
Transfer pipetteAvantor414004-005
XyleneFisher ChemicalX3P-1GAL

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