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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Aqui, fornecemos um procedimento prático para dissecar e realizar análises histológicas e de expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino.

Abstract

A termogênese mediada pelo tecido adiposo marrom (BAT) desempenha um papel importante na regulação do metabolismo, e sua morfologia e função podem ser grandemente impactadas por estímulos ambientais em camundongos e humanos. Atualmente, a MTD interescapular murina (BATi), localizada entre duas escápulas no flanco dorsal superior de camundongos, é o principal depósito de MTD utilizado pelos laboratórios de pesquisa para estudar a função das MTD. Recentemente, alguns depósitos de MTD previamente desconhecidos foram identificados em camundongos, incluindo um análogo ao tecido adiposo marrom supraclavicular humano. Ao contrário do iBAT, o tecido adiposo marrom supraclavicular murino (scBAT) está situado na camada intermediária do pescoço e, portanto, não pode ser acessado tão facilmente.

Para facilitar o estudo de scBAT de camundongos recém-identificados, é apresentado aqui um protocolo detalhando os passos para dissecar scBAT intacta de camundongos pós-natais e adultos. Devido ao pequeno tamanho do scBAT em relação a outros depósitos adiposos, os procedimentos foram modificados e otimizados especificamente para o processamento do scBAT. Entre essas modificações está o uso de um microscópio dissecante durante a coleta de tecidos para aumentar a precisão e homogeneização de amostras de scBAT congeladas para aumentar a eficiência da análise subsequente de qPCR. Com essas otimizações, a identificação, a aparência morfológica e a caracterização molecular da scBAT podem ser determinadas em camundongos.

Introduction

O aumento da prevalência da obesidade nos EUA e no mundo tem despertado grande interesse na compreensão de sua etiologia e na identificação de potenciais tratamentos 1,2. O tecido adiposo desempenha um papel vital no metabolismo, e a desregulação do tecido adiposo pode levar ao desenvolvimento da obesidade. Geralmente, existem dois tipos de tecido adiposo, tecido adiposo branco e marrom. Enquanto o tecido adiposo branco (TAB) pode armazenar energia química e secretar fatores endócrinos, o tecido adiposo marrom (BAT) pode utilizar energia química para gerar calor e manter a temperatura corporal no frio

Protocol

Os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Baylor College of Medicine. Todos os procedimentos foram realizados em camundongos machos C57BL/6J com idade entre 3 semanas e 3 meses de idade. Antes da dissecção, todos os camundongos foram eutanasiados usando o procedimento aprovado de eutanásia de dióxido de carbono em roedores. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo........

Representative Results

Ao contrário do iBAT, que se situa na camada subcutânea do dorso entre duas escápulas, o scBAT situa-se na camada intermediária do pescoço, estendendo-se profundamente entre as camadas do músculo esquelético e a glândula salivar à medida que cresce ao longo da veia jugular externa (Figura 1A). Dissecar scBAT não é tão simples quanto o iBAT. Aqui, fornecemos um procedimento detalhado que inclui etapas cruciais para a dissecação da scBAT intacta d.......

Discussion

Neste protocolo, apresentamos em detalhes os procedimentos de dissecação e processamento de scBAT para análises de H&E e expressão gênica. Como o scBAT reside na camada intermediária do pescoço e fica ao longo das grandes veias, o isolamento desse depósito requer técnica precisa. Especificamente, para obter uma visão clara do depósito, recomendamos colocar o camundongo sob um microscópio dissecante após a abertura do pescoço. Usando um par de pinças de ponto superfino para descascar a glândula salivar e a.......

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado pelo NIDDK do NIH sob o número de prêmio R01DK116899, USDA/ARS sob o número de prêmio 3092-51000-064-000D, e um prêmio piloto do Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute. Os fluxogramas foram produzidos utilizando o BioRender.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
95% Dehydrant Alcohol (Flex 95)Epredia8201
100% Dehydrant Alcohol (Flex 100)Epredia8101
96-well PCR plateBio-RadMLL9601
Aurum Binding Mini ColumnBio-Rad7326826
Aurum High Stringency WashBio-Rad7326803
Aurum Low Stringency WashBio-Rad7326804
Base Molds (for embedding)Tissue-Tek4122
BD PrecisionGlide Needle 21g x 1 1/2"Becton Dickinson305167
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad1840148
Capless Microcentrifuge Tubes 2 mLFisherbrand02-681-453
Centrifuge Eppendorf5430R
CFX Opus 96 Real-Time PCR InstrumentBio-Rad12011319
ChloroformThermo Scientific Chemicals383760010
Cytoseal 60 Low-viscosity mounting mediumEpredia83104
DEPC-Treated WaterAmbionAM 9906
Dissecting MicroscopeNikonSMZ1500
DNase Dilution SolutionBio-Rad7326805
DNase IBio-Rad7326828
dNTPsInvitrogen18427013
Elution solutionBio-Rad7326801
EM 400 embedding medium paraffinLeica Biosystems3801320
Eosin Y (0.5% w/v)RICCA2858-16
Formula R Infiltration medium paraffinLeica Biosystems3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349Bio ExpressS-3200-2
Gill #3 HematoxylinSigma-AldrichGHS332-1L
HCl (for HCL-Ethanol)Fisher ChemicalA142212
IP VI Embedding CassettesLeica Biosystems39LC-550-5-L
Koptec's Pure Ethanol - 200 Proof (for 70% Ethanol)Decon LabsV1001
MgCl2 (25 mM)Thermo Fisher ScientificR0971
Microcentrifuge Tubes 1.7 mLAvantor87003-294
Microseal 'B' Seals (adhseive seals)Bio-RadMSB1001
MicrotomeLeica BiosystemsRM2245
Molecular Biology Grade WaterCorning46-000-CM
Mortar Coors TekThomas Scientific60310
NaCl (for 0.85% saline)Fisher BioreagentsBP358-212
NanoDrop SpectrophotometerNanoDrop TechnologiesND-1000 UV/Vis
Oligo dTInvitrogen18418020
Paraffin Section Flotation BathBoekel Scientific14792V
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-AldrichP6148-500G
PCR Tube StripAvantor76318-802
Pestle by Coors TekThomas Scientific60311
Pestle Pellet MotorKimble749540-0000
Phosphate Buffer Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
Precision Model 19 Vacuum Oven Thermo Fisher ScientificCAT# 51221162
Primer: 36B4  (forward) 10 μM
5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3’
Chen lab Oligo database
Primer: 36B4 (reverse) 10 μM
5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μM
5’ ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (reverse) 10 μM
5’ CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (forward primer) 10 μM
5’ CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Glut 4 (reverse) 10 μM
5’ GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3’
Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (forward) 10 μM
5’ AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3’
Chen lab Oligo database
Primer: PPARg (reserve) 10 μM
5’ AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a (reverse) 10 μM
5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μM
5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (forward) 10 μM
5’ AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3’
Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (reverse) 10 μM
5’ ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3’
Chen lab Oligo database
RNA isolation solution (PureZol)Bio-Rad7326880
RNase Away (surface decontaminant)Thermo Scientific1437535
RNase HNEBM0297S
Rnase inhibitor (RNase Out)Invitrogen10777019
Scintillation Vial (glass)Electron Microscopy Sciences72632
Slide drying bench Electrothermal (Cole-Parmer)MH6616
Stainless staining rackElectron Microscopy Sciences70312-54
Stereo microscope (for embedding)OlympusSZ51
Sugical scissorsMcKesson43-1-104
Superfine point Straight Dissecting ForcepsAvantor82027-402
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
Superscript III Reverse Transcriptase (Includes 5x First-Strand Buffer and 0.1M DTT) Invitrogen18080044
SUR-VET syringe with needle 25 G x 5/8", 1 mLTerumo100281
SYBR Green (qPCR enzyme master mixture)Applied BiosystemsA25778
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set (jars)Electron Microscopy SciencesSKU: 62540-01
TolueneFisher ChemicalT324-1
Transfer pipetteAvantor414004-005
XyleneFisher ChemicalX3P-1GAL

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