בידוד גרעיני מתאי דם שמקורם בהקפאה חוץ גופית

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לחילוץ גרעינים באיכות גבוהה מסוגי תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים בהקפאה, סטרומה/אנדותל ותאי דם שמקורם בהקפאה, לתמיכה בניתוחי ריצוף של הדור הבא של גרעין יחיד. ייצור גרעינים שלמים באיכות גבוהה הוא הכרחי לניסויים מולטיומיים, אך יכול להוות חסם כניסה לשטח עבור מעבדות מסוימות.

Abstract

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) הם פלטפורמות מצוינות להבנת התפתחות הדם, ולתאי דם שמקורם ב- iPSC יש תועלת תרגומית כריאגנטים לבדיקה קלינית וטיפולי תאים הניתנים לטרנספוזציה. הופעתו והרחבתו של ניתוח מולטיומיקס, כולל, אך לא רק, ריצוף RNA של גרעין יחיד (snRNAseq) ו- Assay for Transposase-Accessible Chromatin sequencing (snATACseq), מציע את הפוטנציאל לחולל מהפכה בהבנה שלנו של התפתחות תאים. זה כולל ביולוגיה התפתחותית באמצעות מודלים hematopoietic במבחנה . עם זאת, זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית לבודד גרעינים שלמים מתאים בתרבית או ראשוניים. סוגי תאים שונים דורשים לעתים קרובות תכשירים גרעיניים מותאמים בהתאם לנוקשות התא ותכולתו. קשיים טכניים אלה יכולים להגביל את איכות הנתונים ולשמש מחסום לחוקרים המעוניינים להמשיך במחקרים מולטיומיים. שימור בהקפאה של דגימות נחוץ לעתים קרובות בשל מגבלות באיסוף ו / או עיבוד תאים, ודגימות קפואות יכולות להציג אתגרים טכניים נוספים לבידוד גרעיני שלם. בכתב יד זה, אנו מספקים שיטה מפורטת לבידוד גרעינים באיכות גבוהה מתאים שמקורם ב- iPSC בשלבים שונים של התפתחות המטופויטית במבחנה לשימוש בתהליכי עבודה מולטיומיים של גרעין יחיד. מיקדנו את פיתוח השיטה בבידוד גרעינים מתאי סטרומה/אנדותל דבקים שמקורם ב-iPSC ומתאי אב המטופויטיים שאינם דבקים, שכן אלה מייצגים סוגי תאים שונים מאוד מבחינת זהות מבנית ותאית. שלבי פתרון הבעיות המתוארים הגבילו גושים גרעיניים ופסולת, ואפשרו התאוששות של גרעינים בכמות ובאיכות מספיקות לניתוחים במורד הזרם. שיטות דומות עשויות להיות מותאמות לבידוד גרעינים מסוגי תאים אחרים שמורים בהקפאה.

Introduction

המטופויזיס היא מערכת התפתחותית מאופיינת היטב, אך חוסר יכולת לשחזר את היווצרות תאי הדם במבחנה מדגים הבנה חלקית של גורמים קשורים. מודלים של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) המבוססים על המטופויזה יכולים לעזור להבהיר גורמי התפתחות מרכזיים וביולוגיה קשורה. מערכת iPSC מציעה גם מודל מצוין לחקר הפרעות דם, ותאי דם מבוססי iPSC פותחו כדי לייצר ריאגנטים רלוונטיים מבחינה תרגומית וטיפולית 1,2,3,4. מחקרים חד-תאיים שימשו באופן נרחב לחקר ביולוגיה התפתחותית מבוססת iPSC, כולל סוגי תאים המיוצרים במהלך המטופויזיס⁵. בהשוואה לרי....

Protocol

1. cryopreservation של תאים

1. יש להקפיא >1 x 10⁶ תאים מבודדים שמקורם ב-iPSC לכל מ"ל ב-1 מ"ל של 90% FBS ו-10% DMSO. הכניסו את ההקפאה למיכל הקפאה בטמפרטורה של -80°C כדי להפחית את מהירות ההקפאה ולמטב את התאוששות התאים בת קיימא (Table of Materials). צפו אובדן תאים משמעותי, אשר יכול להשתנות בהתאם לתנאי ה.......

Discussion

שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול
בידוד גרעינים באיכות גבוהה חיוני ליישום מוצלח של שיטות ריצוף הדור הבא המבוססות על גרעין יחיד, המתפתחות במהירות. מתוך הכרה בחסמים הקיימים עבור מעבדות המעוניינות בגישות אלה, במיוחד עבור דגימות שמורות בהקפאה, כוונתנו הייתה לעצב טכניקת בידוד גרעיני המ.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3