Isolamento nuclear de células sanguíneas derivadas criopreservadas in vitro

Summary

Descrevemos um protocolo para extrair núcleos de alta qualidade de tipos de células estromais/endoteliais e sanguíneas derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por criopreservas, para apoiar análises de sequenciamento de próxima geração de núcleo único. A produção de núcleos intactos e de alta qualidade é imperativa para experimentos multiômicos, mas pode ser uma barreira à entrada no campo para alguns laboratórios.

Abstract

Modelos baseados em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) são excelentes plataformas para entender o desenvolvimento do sangue, e as células sanguíneas derivadas de iPSC têm utilidade translacional como reagentes de testes clínicos e terapias de células transfusíveis. O advento e a expansão da análise multiômica, incluindo, entre outros, o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNAseq) e o sequenciamento de cromatina acessível por transposase (snATACseq), oferece o potencial de revolucionar nossa compreensão do desenvolvimento celular. Isso inclui biologia do desenvolvimento usando modelos hematopoiéticos in vitro . No entanto, pode ser tecnicamente desafiador isolar núcleos intactos de células cultivadas ou primárias. Diferentes tipos de células geralmente requerem preparações nucleares personalizadas, dependendo da rigidez e do conteúdo celular. Essas dificuldades técnicas podem limitar a qualidade dos dados e atuar como uma barreira para os investigadores interessados em realizar estudos multiômicos. A criopreservação de amostras é frequentemente necessária devido a limitações na coleta e/ou processamento de células, e amostras congeladas podem apresentar desafios técnicos adicionais para o isolamento nuclear intacto. Neste manuscrito, fornecemos um método detalhado para isolar núcleos de alta qualidade de células derivadas de iPSC em diferentes estágios de desenvolvimento hematopoiético in vitro para uso em fluxos de trabalho multiômicos de núcleo único. Focamos o desenvolvimento do método no isolamento de núcleos de células estromais/endoteliais aderentes derivadas de iPSC e células progenitoras hematopoiéticas não aderentes, pois representam tipos de células muito diferentes em relação à identidade estrutural e celular. As etapas de solução de problemas descritas limitaram a aglomeração e os detritos nucleares, permitindo a recuperação de núcleos em quantidade e qualidade suficientes para análises a jusante. Métodos semelhantes podem ser adaptados para isolar núcleos de outros tipos de células criopreservadas.

Introduction

A hematopoiese é um sistema de desenvolvimento relativamente bem caracterizado, mas a incapacidade de recapitular a formação de células sanguíneas in vitro demonstra uma compreensão incompleta dos fatores relacionados. Modelos de hematopoiese baseados em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) podem ajudar a elucidar os principais fatores de desenvolvimento e a biologia relacionada. O sistema iPSC também oferece um excelente modelo para estudar distúrbios sanguíneos, e células sanguíneas baseadas em iPSC foram desenvolvidas para produzir reagentes traducionais e terapeuticamente relevantes 1,2,3,4.

Protocol

1. Criopreservação de células

1. Congele >1 x 10⁶ células derivadas de iPSC isoladas por mL em 1 mL de 90% de FBS e 10% de DMSO. Coloque os criogenianos em um recipiente de congelamento a -80 ° C para reduzir a velocidade de congelamento e otimizar a recuperação de células viáveis (Tabela de Materiais). Antecipe uma perda celular considerável, que pode variar de acordo com as condições de cultura e a identidade celular.
2. Passar de -80 °C para armaz.......

Discussion

Etapas críticas dentro do protocolo
Isolar núcleos de alta qualidade é essencial para a implementação bem-sucedida das atuais modalidades de sequenciamento de próxima geração baseadas em núcleo único, que estão evoluindo rapidamente. Em reconhecimento às barreiras existentes para laboratórios interessados nessas abordagens, particularmente para espécimes criopreservados, nossa intenção era criar uma técnica de isolamento nuclear adaptada para células previamente congeladas. O isolame.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3