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As espinhas dendríticas são compartimentos pós-sinápticos da maioria das sinapses excitatórias. Alterações na morfologia da coluna dendrítica ocorrem durante o neurodesenvolvimento, envelhecimento, aprendizado e muitos distúrbios neurológicos e psiquiátricos, ressaltando a importância de uma análise confiável da coluna dendrítica. Este protocolo descreve a quantificação da morfologia da coluna dendrítica de forma precisa e reprodutível usando um software automático de reconstrução tridimensional de neurônios.
As conexões sinápticas permitem a troca e o processamento de informações entre os neurônios. O local pós-sináptico das sinapses excitatórias é freqüentemente formado nas espinhas dendríticas. As espinhas dendríticas são estruturas de grande interesse em pesquisas centradas em plasticidade sináptica, neurodesenvolvimento e distúrbios neurológicos e psiquiátricos. Os espinhos dendríticos sofrem modificações estruturais durante sua vida útil, com propriedades como número total de espinhos, tamanho da coluna dendrítica e subtipo morfologicamente definido alterando em resposta a diferentes processos. Delinear os mecanismos moleculares que regulam essas alterações estruturais das espinhas dendríticas depende da medição morfológica. Isso exige uma análise precisa e reprodutível da coluna dendrítica para fornecer evidências experimentais. O presente estudo descreve um protocolo detalhado para quantificação e classificação da coluna dendrítica usando o Neurolucida 360 (software de reconstrução automática de neurônios tridimensionais). Este protocolo permite a determinação das principais propriedades dendríticas da coluna, como densidade total da coluna, volume da cabeça da coluna vertebral e classificação em subtipos da coluna, permitindo assim a análise eficaz dos fenótipos estruturais da coluna dendrítica.
As espinhas dendríticas são saliências de dendritos, muitas vezes compreendendo o local pós-sináptico das sinapses glutamatérgicas 1,2. As espinhas dendríticas são de particular interesse no campo da plasticidade sináptica. As espinhas são frequentemente alteradas quando a força sináptica muda, tornando-se maiores e mais fortes na potenciação sináptica de longo prazo ou menores e mais fracas na depressão sináptica de longo prazo 3,4,5,6,7.....
Todos os procedimentos com animais seguiram as Diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA usando animais em pesquisa intramural e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Saúde Mental.
1. Preparação de fatias fixas do hipocampo
A utilização eficaz deste método de análise começa com a seleção de segmentos dendríticos para traçado. Conforme descrito na Figura 1, os dendritos ideais para rastreamento não estão próximos a outros dendritos. Dendritos executados em paralelo podem resultar na identificação inadequada de espinhos de um dendrito vizinho. Os dendritos que se cruzam diretamente ou correm perpendicularmente em um plano z diferente também adicionam dificuldade si.......
Este protocolo detalha as etapas específicas de preparação da amostra, imagem e o processo de quantificação e classificação da coluna dendrítica usando software de reconstrução tridimensional. Este software é uma ferramenta poderosa capaz de produzir dados estruturais robustos que contribuem para uma gama diversificada de investigações. Ao longo do processo, existem algumas etapas críticas que tornam esse protocolo menos oneroso metodológico e melhoram a produção geral d.......
Gostaríamos de agradecer a Carolyn Smith, Sarah Williams Avram, Ted Usdin e ao NIMH SNIR pela assistência técnica. Além disso, gostaríamos de agradecer ao Grupo de Estudos de Pesquisa Biomédica Bethesda da Colgate University. Este trabalho é apoiado pelo Programa Intramural do NIMH (1ZIAMH002881 a Z.L.).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
518F Immersion Oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
Cryostat | Leica | CM3050S | For slice preparation |
Fine Forceps | FST | 11150-10 | |
Hemostat Forceps | FST | 13020-12 | |
Large Surgical Scissors | FST | 14002-16 | |
LSM 880 Confocal Microscope | Zeiss | LSM 880 | |
Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-541-035 | |
Mini-Peristaltic Pump II | Harvard Apparatus | 70-2027 | For perfusions |
Neurolucida 360 | MBF Bioscience | v2022.1.1 | Spine Analysis Software |
Neurolucida Explorer | MBF Bioscience | v2022.1.1 | Spine Analysis Software |
OCT Compound | Sakura Finetek | 4583 | For cryostat sectioning |
Paraformaldehyde (37%) | Fisherbrand | F79-1 | |
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC | Zeiss | 440762-9904-000 | |
Scalpel Blade | FST | 10022-00 | |
Small Surgical Scissors | FST | 14060-09 | |
Spatula | FST | 10091-12 | |
Sucrose | FIsherbrand | S5-500 | |
Superfrost Plus Microslides | Diagger | ES4951+ | |
Vectashield HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400-10 |
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