ניתוח של חיבור קצה לא הומולוגי ויעילות רקומבינציה הומולוגית בתאי HEK-293T באמצעות מערכות דיווח מבוססות GFP

Summary

פרוטוקול זה מתאר בדיקת הצטרפות קצה חוץ-כרומוזומלית לא הומולוגית (NHEJ) ובדיקת רקומבינציה הומולוגית (HR) כדי לכמת את היעילות של NHEJ ו- HR בתאי HEK-293T.

Abstract

שברי DNA דו-גדיליים (DSBs) מייצגים את נגעי הדנ"א המסוכנים ביותר, המסוגלים לגרום לאובדן מידע גנטי משמעותי ולמוות תאי. בתגובה, תאים משתמשים בשני מנגנונים עיקריים לתיקון DSB: חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית (HR). כימות היעילות של NHEJ ומשאבי אנוש בנפרד הוא חיוני לבחינת המנגנונים והגורמים הרלוונטיים הקשורים לכל אחד מהם. בדיקת NHEJ ובדיקת משאבי אנוש הן שיטות מבוססות המשמשות למדידת היעילות של מסלולי התיקון שלהם. שיטות אלה מסתמכות על פלסמידים שתוכננו בקפידה המכילים גן חלבון פלואורסצנטי ירוק משובש (GFP) עם אתרי זיהוי עבור אנדונוקלאז I-SceI, אשר משרה DSBs. כאן, אנו מתארים את בדיקת NHEJ החוץ-כרומוזומלית ובדיקת HR, הכוללים העברה משותפת של תאי HEK-293T עם פלסמידים EJ5-GFP/DR-GFP, פלסמיד המבטא I-SceI ופלסמיד המבטא mCherry. תוצאות כמותיות של יעילות NHEJ ו- HR מתקבלות על ידי חישוב היחס בין תאים חיוביים ל- GFP לתאים חיוביים mCherry, כפי שנספר על ידי ציטומטריית זרימה. בניגוד לבדיקות משולבות כרומוזומלית, בדיקות חוץ-כרומוזומליות אלה מתאימות יותר לביצוע חקירות השוואתיות המערבות מספר קווי תאים יציבים מבוססים.

Introduction

שבר דנ"א דו-גדילי (DSB) הוא הצורה המזיקה ביותר של נזק לדנ"א, שעלולה להוביל לחוסר יציבות גנומית, סידור מחדש של כרומוזומליים, הזדקנות תאית ומוות תאי אם לא יתוקן מיד¹. שני מסלולים מבוססים היטב, הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית (HR), מוכרים ביעילותם בטיפול ב- DNA DSBs ^2,3. HR נחשב למנגנון נטול שגיאות לתיקון DSB, תוך שימוש ברצפים הומולוגיים בכרומטיד האחות כתבנית לשחזור התצורה המקורית של מולקולת הדנ"א הפגועה³. NHEJ, לעומת זאת, הוא מסלול תיקון DSB מועד לשגיאות שמצטרף לקצוות הדנ"א השבורים מבלי להסתמך על תבנית^2<....

Protocol

1. בידוד פלסמיד

1. הפוך E. coli מוכשר עם פלסמידים EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (I-Sce I המבטא פלסמיד), ו- PCI2-HA-mCherry (mCherry המבטא פלסמיד) (ראה טבלת חומרים) בהתאם לפרוטוקול הטרנספורמציה הסטנדרטי²⁰.
   הערה: PCI2-HA-mCherry ניתן להחליף עם mCherry או DsRed אחרים המבטאים פלסמידים.
2. טפחו את.......

Discussion

השיטה המתוארת כאן שימשה במספר מאמרים להערכת יעילות NHEJ ויעילות משאבי אנוש 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. שיטה זו רלוו?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 cm dishes	BBI	F611202-9001
6 well plates	Corning	3516
Ampicillin	Beyotime	ST007	Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent Cells	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmid  kit	TIANGEN	DP117	alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubes	FALCON	352054
Fetal bovine serum	CLARK	FB25015
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	Treestar		alternative analysis software can be used
HEK-293T cells	National Infrastructure of Cell Line Resource	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	alternative transfection regents can be used
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherry			alternative plasmids containing DsRed can be used
Trypsin	Gibco	25200-056