Analisi dell'unione di estremità non omologhe e dell'efficienza di ricombinazione omologa in cellule HEK-293T utilizzando sistemi reporter basati su GFP

Summary

Questo protocollo descrive un saggio di giunzione delle estremità extracromosomiche non omologhe (NHEJ) e un saggio di ricombinazione omologa (HR) per quantificare l'efficienza di NHEJ e HR nelle cellule HEK-293T.

Abstract

Le rotture del doppio filamento del DNA (DSB) rappresentano le lesioni del DNA più pericolose, in grado di indurre una sostanziale perdita di informazioni genetiche e la morte cellulare. In risposta, le cellule impiegano due meccanismi primari per la riparazione del DSB: l'unione delle estremità non omologa (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR). Quantificare separatamente l'efficienza di NHEJ e HR è fondamentale per esplorare i meccanismi e i fattori rilevanti associati a ciascuno. Il test NHEJ e il test HR sono metodi consolidati utilizzati per misurare l'efficienza dei rispettivi percorsi di riparazione. Questi metodi si basano su plasmidi meticolosamente progettati contenenti un gene della proteina fluorescente verde (GFP) interrotto con siti di riconoscimento per l'endonucleasi I-SceI, che induce DSB. Qui, descriviamo il saggio NHEJ extracromosomico e il saggio HR, che comportano la co-trasfezione di cellule HEK-293T con plasmidi EJ5-GFP/DR-GFP, un plasmide che esprime I-SceI e un plasmide che esprime mCherry. I risultati quantitativi dell'efficienza NHEJ e HR si ottengono calcolando il rapporto tra le cellule GFP-positive e le cellule mCherry-positive, come contato mediante citometria a flusso. A differenza dei saggi cromosomicamente integrati, questi saggi extracromosomici sono più adatti per condurre indagini comparative che coinvolgono più linee cellulari stabili stabili.

Introduction

Una rottura del doppio filamento di DNA (DSB) è la forma più deleteria di danno al DNA, che può portare a instabilità del genoma, riarrangiamenti cromosomici, senescenza cellulare e morte cellulare se non riparata prontamente¹. Due vie ben consolidate, l'unione delle estremità non omologhe (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR), sono riconosciute per la loro efficacia nell'affrontare i DSB^{del DNA 2,3}. L'HR è considerato un meccanismo privo di errori per la riparazione del DSB, utilizzando sequenze omologhe nel cromatide fratello come modello per ripristinare la co....

Protocol

1. Isolamento plasmidico

1. Trasformare E. coli competente con i plasmidi EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (plasmide che esprime I-Sce I) e PCI2-HA-mCherry (plasmide che esprime mCherry) (vedi Tabella dei materiali) seguendo il protocollo di trasformazione standard²⁰.
   NOTA: PCI2-HA-mCherry può essere sostituito con altri plasmidi che esprimono mCherry o DsRed.
2. Coltivare l'E. coli trasformato in 500 mL di terreno LB liquido .......

Discussion

Il metodo qui descritto è stato impiegato in diversi articoli per valutare l'efficienza NHEJ e l'efficienza HR 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Questo metodo è pertinente per chiarire i me.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 cm dishes	BBI	F611202-9001
6 well plates	Corning	3516
Ampicillin	Beyotime	ST007	Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent Cells	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmid  kit	TIANGEN	DP117	alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubes	FALCON	352054
Fetal bovine serum	CLARK	FB25015
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	Treestar		alternative analysis software can be used
HEK-293T cells	National Infrastructure of Cell Line Resource	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	alternative transfection regents can be used
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherry			alternative plasmids containing DsRed can be used
Trypsin	Gibco	25200-056