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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo descreve um ensaio extracromossômico de junção final não homóloga (NHEJ) e um ensaio de recombinação homóloga (HR) para quantificar a eficiência de NHEJ e HR em células HEK-293T.

Abstract

As quebras de fita dupla de DNA (DSBs) representam as lesões de DNA mais perigosas, capazes de induzir perda substancial de informação genética e morte celular. Em resposta, as células empregam dois mecanismos primários para o reparo de DSB: junção final não homóloga (NHEJ) e recombinação homóloga (HR). Quantificar a eficiência do NHEJ e da FC separadamente é crucial para explorar os mecanismos e fatores relevantes associados a cada um. O ensaio NHEJ e o ensaio HR são métodos estabelecidos usados para medir a eficiência de suas respectivas vias de reparo. Esses métodos dependem de plasmídeos meticulosamente projetados contendo um gene de proteína fluorescente verde (GFP) interrompido com locais de reconhecimento para endonuclease I-SceI, que induz DSBs. Aqui, descrevemos o ensaio extracromossômico NHEJ e o ensaio HR, que envolvem a co-transfecção de células HEK-293T com plasmídeos EJ5-GFP/DR-GFP, um plasmídeo que expressa I-SceI e um plasmídeo que expressa mCherry. Os resultados quantitativos da eficiência de NHEJ e HR são obtidos calculando a proporção de células positivas para GFP e células positivas para mCherry, conforme contado por citometria de fluxo. Em contraste com os ensaios cromossomicamente integrados, esses ensaios extracromossômicos são mais adequados para a realização de investigações comparativas envolvendo várias linhagens celulares estáveis estabelecidas.

Introduction

Uma quebra de fita dupla de DNA (DSB) é a forma mais deletéria de dano ao DNA, potencialmente levando à instabilidade do genoma, rearranjos cromossômicos, senescência celular e morte celular se não for reparada prontamente1. Duas vias bem estabelecidas, junção de extremidade não homóloga (NHEJ) e recombinação homóloga (HR), são reconhecidas por sua eficácia no tratamento de DSBs de DNA 2,3. A HR é considerada um mecanismo livre de erros para o reparo de DSB, utilizando sequências homólogas na cromátide irmã como modelo para restaurar a configuração original da molé....

Protocol

1. Isolamento de plasmídeo

  1. Transformar E. coli competente com os plasmídeos EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (plasmídeo que expressa I-Sce I) e PCI2-HA-mCherry (plasmídeo que expressa mCherry) (ver Tabela de Materiais) seguindo o protocolo de transformação padrão20.
    NOTA: PCI2-HA-mCherry pode ser substituído por outros plasmídeos que expressam mCherry ou DsRed.
  2. Cultive a E. coli transformada em 500 mL de meio LB .......

Representative Results

Para garantir a precisão da análise de NHEJ e RH, é necessária a implementação de uma estratégia adequada de ajuste e controle de remuneração. Normalmente, a fluorescência mCherry não se manifesta no detector GFP ao usar um filtro de 530 nm. No entanto, em casos de células exibindo expressão de GFP extremamente alta, a fluorescência de GFP pode contaminar o detector mCherry ao usar um filtro de 575 nm. Para resolver essas preocupações, o controle negativo, o controle de cor única GFP e as amostras de con.......

Discussion

O método aqui descrito tem sido empregado em vários trabalhos para avaliar a eficiência do NHEJ e a eficiência da FC 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Este método é pertinente para eluc.......

Disclosures

Não há conflitos de interesse a serem divulgados.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi financiada pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Heilongjiang da China (YQ2022C036) e pela Fundação de Inovação de Pós-Graduação da Universidade Médica de Qiqihar (QYYCX2022-06). Figura 1 produzida usando MedPeer.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6 cm dishes BBIF611202-9001
6 well platesCorning3516
AmpicillinBeyotimeST007Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent CellsTIANGENCB101
DMEMHycloneSH30022.01
DR-GFPAddgene26475
EJ5-GFPAddgene44026
EndoFree Maxi Plasmid  kitTIANGENDP117alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubesFALCON352054
Fetal bovine serumCLARKFB25015
Flow cytometerBD BiosciencesBD FACSCalibur
FlowJo V.10.1Treestaralternative analysis software can be used
HEK-293T cellsNational Infrastructure of Cell Line Resource1101HUM-PUMC000091
Lipo3000InvitrogenL3000015alternative transfection regents can be used
PBSBiosharpBL601A
pCBASceIAddgene26477I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherryalternative plasmids containing DsRed can be used
TrypsinGibco25200-056

References

  1. Huang, R., Zhou, P. K. DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254 (2021).
  2. Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R.

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