Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В этом протоколе описываются экстрахромосомные негомологические тесты на соединение концов (NHEJ) и гомологичные рекомбинационные анализы (HR) для количественной оценки эффективности NHEJ и HR в клетках HEK-293T.

Abstract

Двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) представляют собой наиболее опасные повреждения ДНК, способные вызвать значительную потерю генетической информации и гибель клеток. В ответ на это клетки используют два основных механизма репарации DSB: негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологичную рекомбинацию (HR). Количественная оценка эффективности NHEJ и HR по отдельности имеет решающее значение для изучения соответствующих механизмов и факторов, связанных с каждым из них. Анализ NHEJ и анализ HR являются установленными методами, используемыми для измерения эффективности соответствующих путей восстановления. Эти методы основаны на тщательно спроектированных плазмидах, содержащих разрушенный ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) с сайтами узнавания эндонуклеазы I-SceI, которая индуцирует DSB. В данной работе мы описываем внехромосомный анализ NHEJ и анализ HR, которые включают совместную трансфекцию клеток HEK-293T с плазмидами EJ5-GFP/DR-GFP, экспрессирующую плазмиду I-SceI и экспрессирующую плазмиду mCherry. Количественные результаты эффективности NHEJ и HR получены путем расчета соотношения GFP-положительных клеток к mCherry-положительным клеткам, подсчитанным с помощью проточной цитометрии. В отличие от хромосомно-интегрированных анализов, эти внехромосомные анализы больше подходят для проведения сравнительных исследований с участием нескольких установленных стабильных клеточных линий.

Introduction

Двухцепочечный разрыв ДНК (DSB) является наиболее опасной формой повреждения ДНК, потенциально приводящей к нестабильности генома, хромосомным перестройкам, клеточному старению и гибели клеток, если его своевременно не восстановить. Два хорошо установленных пути, негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологичная рекомбинация (HR), признаны эффективными в работе с DSB ДНК 2,3. HR считается безошибочным механизмом репарации DSB, использующим гомологичные последовательности в сестринской хроматиде в качестве матрицы для восстановления исходной конфигурации повреж....

Protocol

1. Выделение плазмид

  1. Трансформируйте компетентную E. coli с плазмидами EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (экспрессирующая плазмида I-SceI) и PCI2-HA-mCherry (экспрессирующая плазмида mCherry) (см. Таблицу материалов) в соответствии со стандартным протоколом трансформации20.
    ?.......

Representative Results

Для обеспечения точности анализа NHEJ и HR необходимо внедрить подходящую стратегию корректировки компенсации и стробирования. Как правило, флуоресценция mCherry не проявляется в детекторе GFP при использовании фильтра 530 нм. Однако в тех случаях, когда клетки демонстрируют чрезвычайно высок.......

Discussion

Описанный здесь метод был использован в нескольких работах для оценки эффективности NHEJ и эффективности управления персоналом 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19........

Acknowledgements

Это исследование финансировалось Фондом естественных наук провинции Хэйлунцзян в Китае (YQ2022C036) и Фондом инноваций для выпускников Медицинского университета Цицикар (QYYCX2022-06). Рисунок 1 получен с использованием MedPeer.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6 cm dishes BBIF611202-9001
6 well platesCorning3516
AmpicillinBeyotimeST007Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent CellsTIANGENCB101
DMEMHycloneSH30022.01
DR-GFPAddgene26475
EJ5-GFPAddgene44026
EndoFree Maxi Plasmid  kitTIANGENDP117alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubesFALCON352054
Fetal bovine serumCLARKFB25015
Flow cytometerBD BiosciencesBD FACSCalibur
FlowJo V.10.1Treestaralternative analysis software can be used
HEK-293T cellsNational Infrastructure of Cell Line Resource1101HUM-PUMC000091
Lipo3000InvitrogenL3000015alternative transfection regents can be used
PBSBiosharpBL601A
pCBASceIAddgene26477I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherryalternative plasmids containing DsRed can be used
TrypsinGibco25200-056

References

  1. Huang, R., Zhou, P. K. DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254 (2021).
  2. Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R.

Explore More Articles

NHEJGFPHEK 293Ti SceI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved