Анализ эффективности негомологичного соединения концов и гомологичной рекомбинации в клетках HEK-293T с использованием репортерных систем на основе GFP

Summary

В этом протоколе описываются экстрахромосомные негомологические тесты на соединение концов (NHEJ) и гомологичные рекомбинационные анализы (HR) для количественной оценки эффективности NHEJ и HR в клетках HEK-293T.

Abstract

Двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) представляют собой наиболее опасные повреждения ДНК, способные вызвать значительную потерю генетической информации и гибель клеток. В ответ на это клетки используют два основных механизма репарации DSB: негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологичную рекомбинацию (HR). Количественная оценка эффективности NHEJ и HR по отдельности имеет решающее значение для изучения соответствующих механизмов и факторов, связанных с каждым из них. Анализ NHEJ и анализ HR являются установленными методами, используемыми для измерения эффективности соответствующих путей восстановления. Эти методы основаны на тщательно спроектированных плазмидах, содержащих разрушенный ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) с сайтами узнавания эндонуклеазы I-SceI, которая индуцирует DSB. В данной работе мы описываем внехромосомный анализ NHEJ и анализ HR, которые включают совместную трансфекцию клеток HEK-293T с плазмидами EJ5-GFP/DR-GFP, экспрессирующую плазмиду I-SceI и экспрессирующую плазмиду mCherry. Количественные результаты эффективности NHEJ и HR получены путем расчета соотношения GFP-положительных клеток к mCherry-положительным клеткам, подсчитанным с помощью проточной цитометрии. В отличие от хромосомно-интегрированных анализов, эти внехромосомные анализы больше подходят для проведения сравнительных исследований с участием нескольких установленных стабильных клеточных линий.

Introduction

Двухцепочечный разрыв ДНК (DSB) является наиболее опасной формой повреждения ДНК, потенциально приводящей к нестабильности генома, хромосомным перестройкам, клеточному старению и гибели клеток, если его своевременно не восстановить^. Два хорошо установленных пути, негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологичная рекомбинация (HR), признаны эффективными в работе с DSB ДНК ^2,3. HR считается безошибочным механизмом репарации DSB, использующим гомологичные последовательности в сестринской хроматиде в качестве матрицы для восстановления исходной конфигурации повреж....

Protocol

1. Выделение плазмид

1. Трансформируйте компетентную E. coli с плазмидами EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (экспрессирующая плазмида I-SceI) и PCI2-HA-mCherry (экспрессирующая плазмида mCherry) (см. Таблицу материалов) в соответствии со стандартным протоколом трансформации²⁰.
   ?.......

Discussion

Описанный здесь метод был использован в нескольких работах для оценки эффективности NHEJ и эффективности управления персоналом 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19.^.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 cm dishes	BBI	F611202-9001
6 well plates	Corning	3516
Ampicillin	Beyotime	ST007	Working concentration: 100 μg/mL
DH5α Competent Cells	TIANGEN	CB101
DMEM	Hyclone	SH30022.01
DR-GFP	Addgene	26475
EJ5-GFP	Addgene	44026
EndoFree Maxi Plasmid  kit	TIANGEN	DP117	alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used
FACS tubes	FALCON	352054
Fetal bovine serum	CLARK	FB25015
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur
FlowJo V.10.1	Treestar		alternative analysis software can be used
HEK-293T cells	National Infrastructure of Cell Line Resource	1101HUM-PUMC000091
Lipo3000	Invitrogen	L3000015	alternative transfection regents can be used
PBS	Biosharp	BL601A
pCBASceI	Addgene	26477	I-SceI expressing plasmid
PCI2-HA-mCherry			alternative plasmids containing DsRed can be used
Trypsin	Gibco	25200-056