A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
В этом протоколе описываются экстрахромосомные негомологические тесты на соединение концов (NHEJ) и гомологичные рекомбинационные анализы (HR) для количественной оценки эффективности NHEJ и HR в клетках HEK-293T.
Двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) представляют собой наиболее опасные повреждения ДНК, способные вызвать значительную потерю генетической информации и гибель клеток. В ответ на это клетки используют два основных механизма репарации DSB: негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологичную рекомбинацию (HR). Количественная оценка эффективности NHEJ и HR по отдельности имеет решающее значение для изучения соответствующих механизмов и факторов, связанных с каждым из них. Анализ NHEJ и анализ HR являются установленными методами, используемыми для измерения эффективности соответствующих путей восстановления. Эти методы основаны на тщательно спроектированных плазмидах, содержащих разрушенный ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) с сайтами узнавания эндонуклеазы I-SceI, которая индуцирует DSB. В данной работе мы описываем внехромосомный анализ NHEJ и анализ HR, которые включают совместную трансфекцию клеток HEK-293T с плазмидами EJ5-GFP/DR-GFP, экспрессирующую плазмиду I-SceI и экспрессирующую плазмиду mCherry. Количественные результаты эффективности NHEJ и HR получены путем расчета соотношения GFP-положительных клеток к mCherry-положительным клеткам, подсчитанным с помощью проточной цитометрии. В отличие от хромосомно-интегрированных анализов, эти внехромосомные анализы больше подходят для проведения сравнительных исследований с участием нескольких установленных стабильных клеточных линий.
Двухцепочечный разрыв ДНК (DSB) является наиболее опасной формой повреждения ДНК, потенциально приводящей к нестабильности генома, хромосомным перестройкам, клеточному старению и гибели клеток, если его своевременно не восстановить. Два хорошо установленных пути, негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологичная рекомбинация (HR), признаны эффективными в работе с DSB ДНК 2,3. HR считается безошибочным механизмом репарации DSB, использующим гомологичные последовательности в сестринской хроматиде в качестве матрицы для восстановления исходной конфигурации повреж....
1. Выделение плазмид
Для обеспечения точности анализа NHEJ и HR необходимо внедрить подходящую стратегию корректировки компенсации и стробирования. Как правило, флуоресценция mCherry не проявляется в детекторе GFP при использовании фильтра 530 нм. Однако в тех случаях, когда клетки демонстрируют чрезвычайно высок.......
Описанный здесь метод был использован в нескольких работах для оценки эффективности NHEJ и эффективности управления персоналом 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19........
Это исследование финансировалось Фондом естественных наук провинции Хэйлунцзян в Китае (YQ2022C036) и Фондом инноваций для выпускников Медицинского университета Цицикар (QYYCX2022-06). Рисунок 1 получен с использованием MedPeer.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
6 cm dishes | BBI | F611202-9001 | |
6 well plates | Corning | 3516 | |
Ampicillin | Beyotime | ST007 | Working concentration: 100 μg/mL |
DH5α Competent Cells | TIANGEN | CB101 | |
DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
DR-GFP | Addgene | 26475 | |
EJ5-GFP | Addgene | 44026 | |
EndoFree Maxi Plasmid kit | TIANGEN | DP117 | alternative endotoxin-free plasmid extraction kit can be used |
FACS tubes | FALCON | 352054 | |
Fetal bovine serum | CLARK | FB25015 | |
Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | |
FlowJo V.10.1 | Treestar | alternative analysis software can be used | |
HEK-293T cells | National Infrastructure of Cell Line Resource | 1101HUM-PUMC000091 | |
Lipo3000 | Invitrogen | L3000015 | alternative transfection regents can be used |
PBS | Biosharp | BL601A | |
pCBASceI | Addgene | 26477 | I-SceI expressing plasmid |
PCI2-HA-mCherry | alternative plasmids containing DsRed can be used | ||
Trypsin | Gibco | 25200-056 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved