Modelli tridimensionali di coltura cellulare per studiare la barriera epiteliale nell'esofagite eosinofila

Summary

Qui viene fornito un protocollo per la coltura di organoidi esofagei umani e la coltura dell'interfaccia aria-liquido. La coltura dell'interfaccia aria-liquido degli organoidi esofagei può essere utilizzata per studiare l'impatto delle citochine sulla barriera epiteliale esofagea.

Abstract

L'epitelio squamoso dell'esofago è esposto direttamente all'ambiente, affrontando continuamente antigeni estranei, inclusi antigeni alimentari e microbi. Mantenere l'integrità della barriera epiteliale è fondamentale per prevenire le infezioni ed evitare l'infiammazione causata da antigeni innocui di origine alimentare. Questo articolo fornisce protocolli semplificati per la generazione di organoidi esofagei umani e colture di interfaccia aria-liquido da biopsie di pazienti per studiare il compartimento epiteliale dell'esofago nel contesto dell'omeostasi e della malattia tissutale. Questi protocolli sono stati pietre miliari scientifiche significative nell'ultimo decennio, descrivendo strutture tridimensionali simili a organi da cellule primarie derivate da pazienti, organoidi e colture di interfaccia aria-liquido. Offrono la possibilità di studiare la funzione di specifiche citochine, fattori di crescita e vie di segnalazione nell'epitelio esofageo all'interno di un quadro tridimensionale, mantenendo le proprietà fenotipiche e genetiche del donatore. Gli organoidi forniscono informazioni sulla microarchitettura tissutale valutando il trascrittoma e il proteoma dopo la stimolazione delle citochine. Al contrario, le colture di interfaccia aria-liquido consentono di valutare l'integrità della barriera epiteliale attraverso misure di resistenza transepiteliale (TEER) o di flusso di macromolecole. La combinazione di questi organoidi e colture di interfaccia aria-liquido è uno strumento potente per far progredire la ricerca in condizioni di barriera epiteliale esofagea compromessa.

Introduction

L'infiammazione esofagea compromette l'integrità della barriera epiteliale ^1,2,3,4,5, come osservato nell'esofagite eosinofila (EoE), una malattia infiammatoria cronica dell'esofago^6-dominata da Th2. L'EoE è stata descritta per la prima volta negli anni '90 ^7,8 ed è prevalentemente indotta dagli antigeni alimentari ^{9,10,11,12,13....}

Protocol

Le procedure sono state approvate dalla commissione d'etica della Svizzera nordoccidentale e centrale (EKNZ; ID progetto 2019-00273). Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto per l'uso sperimentale delle biopsie prima dell'esame endoscopico. I reagenti e le attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Isolamento cellulare per organoidi esofagei derivati da pazienti

NOTA: Un ele.......

Discussion

Le procedure fornite consentono la coltivazione di organoidi derivati da pazienti e colture di ALI con elevate prospettive di successo. Il protocollo degli organoidi è stato adattato dal primo protocollo pubblicato che riporta la generazione di organoidi esofagei umani²⁶ e da un protocollo³² pubblicato di recente. Sherill e colleghi hanno descritto il modello ALI²². Gli organoidi e i modelli di coltura ALI si assistono a vicenda nello studio dell'im.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1250 µL Griptip - Filter	Integra	4445
300 µL Griptip - Filter	Integra	4435
70 µM cell strainer	Sarstedt	83.3945.070
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich (Merck)	A4544
Bovine pituitary extract	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	3700015
Calcium chloride	Sigma-Aldrich (Merck)	21115
Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures	Greiner Bio-One	7.657 185
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear	R&D Systems (Bio-Techne)	3532-010-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade	Carl Roth	A994
Dispase I	Corning	354235
Dispase II	Sigma-Aldrich (Merck)	D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (DPBS)	Sigma-Aldrich (Merck)	D8537
EVE Automated Cell Counter	NanoEntek	EVE-MC
EVE Cell counting slide	NanoEntek	EVS-050
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Falcon	352235
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran	Sigma-Aldrich (Merck)	FD4	average mol wt 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R	Thermo Fisher Scientific	75004518
Human recombinant epidermal growth factor	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	3700015
Keratinocyte-SFM	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	17005042
Penicillin-Streptomycin	Gibco (Thermo Fischer Scientific)	15140122
Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein	R&D Systems (Bio-Techne)	251-KG-010/CF
Screw cap tube, 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Single Channel EVOLVE 100-1000 µL	Integra	3018
Single Channel EVOLVE 20-200 µL	Integra	3016
Syringe 1 mL		1134950
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000015
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma-Aldrich (Merck)	T9128
Trypsin-EDTA	SAFC Biosciences (Merck)	59418C
Y27632 dihydrochloride	Tocris (Bio-Techne)	1254