A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Трехмерные модели клеточных культур для исследования эпителиального барьера при эозинофильном эзофагите
In This Article
Summary
Здесь представлен протокол культивирования органоидов пищевода человека и культуры границы раздела воздух-жидкость. Культура воздушно-жидкостного интерфейса органоидов пищевода может быть использована для изучения влияния цитокинов на эпителиальный барьер пищевода.
Abstract
Плоский эпителий пищевода подвергается непосредственному воздействию окружающей среды, постоянно сталкиваясь с чужеродными антигенами, включая пищевые антигены и микробы. Поддержание целостности эпителиального барьера имеет решающее значение для предотвращения инфекций и предотвращения воспаления, вызванного безвредными антигенами пищевого происхождения. В данной статье представлены упрощенные протоколы получения органоидов пищевода человека и культур воздушно-жидкостных границ раздела из биопсии пациента для изучения эпителиального компартмента пищевода в контексте тканевого гомеостаза и заболевания. Эти протоколы стали важными научными вехами за последнее десятилетие, описывая трехмерные органоподобные структуры из первичных клеток, полученных от пациента, органоидов и культур воздушно-жидкостных границ раздела. Они дают возможность исследовать функцию специфических цитокинов, факторов роста и сигнальных путей в эпителии пищевода в трехмерной структуре, сохраняя при этом фенотипические и генетические свойства донора. Органоиды предоставляют информацию о микроархитектуре тканей путем оценки транскриптома и протеома после цитокиновой стимуляции. В отличие от этого, культуры на границе раздела воздух-жидкость позволяют оценить целостность эпителиального барьера с помощью трансэпителиального сопротивления (TEER) или измерения потока макромолекул. Объединение этих органоидов и культур воздушно-жидкостных границ раздела является мощным инструментом для продвижения исследований в условиях нарушенного эпителиального барьера пищевода.
Introduction
Воспаление пищевода нарушает целостность эпителиального барьера 1,2,3,4,5, что наблюдается при эозинофильном эзофагите (ЭоЭ), хроническом воспалительном заболевании пищевода с преобладанием Th26. EoE был впервые описан в 1990-х годах как 7,8 и индуцируется преимущественно пищевыми антигенами 9,10,11,12,13.
Protocol
Процедуры были одобрены комитетом по этике Северо-Западной и Центральной Швейцарии (EKNZ; Идентификатор проекта 2019-00273). Все пациенты предоставили письменное информированное согласие на экспериментальное использование биопсии до проведения эндоскопического исследования. Реагенты и об.......
Representative Results
Органоиды пищевода будут расти из первичных клеток, извлеченных из биопсии пациента в соответствии с инструкциями предоставленного протокола, как задокументировано с помощью инвертированного светлопольного микроскопа (Рисунок 1). Эпителиальные ASC начинают образовыва.......
Discussion
Проводимые процедуры позволяют культивировать органоиды и культуры ОЛ пациентского происхождения с высокими перспективами успеха. Протокол на основе органоидов был взят из первого опубликованного протокола, в котором сообщалось о создании органоидов пищеводачеловека26.......
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgements
Грант SNSF 310030_219210 для J.H.N. поддержал публикацию этой рукописи без ограничений. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1250 µL Griptip - Filter | Integra | 4445 | |
| 300 µL Griptip - Filter | Integra | 4435 | |
| 70 µM cell strainer | Sarstedt | 83.3945.070 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich (Merck) | A4544 | |
| Bovine pituitary extract | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | |
| Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures | Greiner Bio-One | 7.657 185 | |
| Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear | R&D Systems (Bio-Techne) | 3532-010-02 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade | Carl Roth | A994 | |
| Dispase I | Corning | 354235 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich (Merck) | D4693 | |
| Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich (Merck) | D8537 | |
| EVE Automated Cell Counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| EVE Cell counting slide | NanoEntek | EVS-050 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran | Sigma-Aldrich (Merck) | FD4 | average mol wt 3000-5000 |
| Heraeus - Megafuge 40R | Thermo Fisher Scientific | 75004518 | |
| Human recombinant epidermal growth factor | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Keratinocyte-SFM | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 17005042 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 15140122 | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein | R&D Systems (Bio-Techne) | 251-KG-010/CF | |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Single Channel EVOLVE 100-1000 µL | Integra | 3018 | |
| Single Channel EVOLVE 20-200 µL | Integra | 3016 | |
| Syringe 1 mL | 1134950 | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich (Merck) | T9128 | |
| Trypsin-EDTA | SAFC Biosciences (Merck) | 59418C | |
| Y27632 dihydrochloride | Tocris (Bio-Techne) | 1254 |
References
- Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
- Davis, B. P., et al.
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved