دعمت منحة SNSF 310030_219210 إلى J.H.N. نشر هذه المخطوطة دون قيود. تم إنشاء الشكل 1 بمساعدة BioRender.com.

تمت الموافقة على الإجراءات من قبل لجنة الأخلاقيات في شمال غرب ووسط سويسرا (EKNZ; معرف المشروع 2019-00273). قدم جميع المرضى موافقة خطية مستنيرة على الاستخدام التجريبي للخزعات قبل الفحص بالمنظار. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.
1. عزل الخلاي?...

عضويات المريء البشرية وبروتوكولات ثقافة واجهة الهواء السائل

تسمح الإجراءات المقدمة بزراعة المواد العضوية المشتقة من المريض وثقافات ALI مع احتمالات عالية للنجاح. تم تكييف بروتوكول العضوي من أول بروتوكول منشور يبلغ عن توليد عضويات المريء البشري26 ومن بروتوكول32 المنشور مؤخرا. وصف شيريل وزملاؤه نموذج ALI22. تساعد ال...

يضر التهاب المريء بسلامة الحاجز الظهاري1،2،3،4،5 ، كما لوحظ في التهاب المريء اليوزيني (EoE) ، وهو مرض التهابي مزمن يهيمن عليه Th2 في المريء6. تم وصف EoE لأول مرة في تسعينيات القرن العشرين7،8 ويتم تحريضه في الغالب بواسطة مستضدات الغذاء9،10،11،12،13. الأعراض الأكثر شيوعا ل EoE في السكان البالغين هي عسر البلع وانحشار الطعام14. في الأطفال ، يظهر EoE عادة مع الفشل في النمو ، ورفض الطعام ، والقيء ، وآلام البطن15. حددت دراسات الارتباط على مستوى الجينوم (GWAS) جينات خطر EoE المشاركة في سلامة الحاجز الظهاري ، مما أدى إلى نقل الظهارة إلى بؤرة أبحاث EoE16،17،18. كشفت EoE transcriptomics كذلك أن عملية التمايز الضعيفة وتضخم المنطقة القاعدية التفاعلية يتسببان في وظيفة الحاجز للخطر لظهارة المريء3،5،19،20،21،22. أدى الفهم المبكر لكون EoE مرضا بوساطة Th26 إلى اكتشاف IL-13 كوسيط قيادة عن طريق الإخلال بسلامة الظهارة3،4،21،23. توفر الأنظمة التجريبية التي تسمح بتشريح التأثيرات بوساطة السيتوكين على السلامة الظهارية من ضعف الحاجز الداخلي من خلال الاستعداد الوراثي إمكانية دراسة التفاعل المعقد بين الخلايا المناعية والظهارة في EoE. تم اقتراح عضويات المريء البشرية ومزارع واجهة الهواء السائل (ALI) كأدوات قيمة لتحليل عواقب تحفيز السيتوكين على سلامة الظهارة5.
تم إنشاء البروتوكول الأول لتوليد عضويات المريء المشتقة من الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة البالغة (ASC) بعد خمس سنوات من التقارير المنشورة الأولى عن العضويات المعوية في عام 2009 باستخدام Lgr5 + ASCs المعوية التي تلخص المقصورة الظهارية للأمعاءالدقيقة 24. كان DeWard et al. رائدا في توليد المواد العضوية من الخلايا الظهارية المريئيةللفئران 25. في عام 2018 ، قام Kasagi et al. بتوليد عضويات المريء البشري من خط خلايا ظهارة المريء الحرشفية البشرية الخالدة EPC2-hTERT والخلايا الأولية المشتقة من المريض26. في نفس العام ، نجح Zhang et al. في توليد عضويات المريء المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC). لقد حددوا أهمية تثبيط TGFβ والبروتين المورفولوجي العظمي (BMP) لتطوير الخلايا السلفية المريئية (EPC) والدور الحاسم لإشارات Notch في تمايز الظهارة الحرشفية الطبقية26,27. استكمل تريسنو وزملاؤه هذه النتائج من خلال تحديد Sox2 كمثبط Wnt يوجه مصير النمو نحو تمايز المريء28. أدت التحسينات اللاحقة للبروتوكولات والتركيب المتوسط وظروف الاستزراع إلى زيادة معدل تكوين الأعضاء وجعلت الاستزراع الفرعي واستعادة المواد العضوية بعد الحفظ بالتبريد ممكنا26،29،30،31،32. على الرغم من أن هذه الكائنات العضوية هي أدوات قوية لدراسة بنية الأنسجة والتعبير عن الجينات المستهدفة المحتملة بعد التحفيز بالسيتوكينات ، إلا أن عضويات المريء لن توفر إمكانية قياس المقاومة عبر الظهارة (TEER) أو تدفق الجزيئات الكبيرة كمقاييس مباشرة لسلامة الحاجز. كما وصفه شيريل وزملاؤهسابقا 22 ، تسمح ثقافات ALI التي تنمذجة التمايز الظهاري4 بإجراء تقييمات مباشرة للسلامة الظهارية. يعد الجمع بين المواد العضوية المشتقة من المريض ومزارع ALI أداة قوية للتحقيق في بنية الأنسجة وسلامة الحاجز الظهاري في EoE.
فيما يلي إجراءات مع تعليمات لعزل الخلايا القابلة للحياة من خزعات المريء وإنشاء مزارع عضوية المريء و ALI التي يمكن استخدامها بشكل أكبر لدراسة آثار السيتوكينات على سلامة الحاجز.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainer</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3945.070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pituitary extract</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>7.657 185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>3532-010-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline&#160; (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVE-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell counting slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>FD4</td>
			<td>average mol wt 3000-5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus - Megafuge&#160; 40R&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant epidermal growth factor</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein</td>
			<td>R&amp;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>251-KG-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 100-1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 20-200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td></td>
			<td>1134950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T9128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>SAFC Biosciences (Merck)</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris (Bio-Techne)</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional cell culture models to investigate the epithelial barrier in eosinophilic esophagitis 

تتعرض ظهارة المريء الحرشفية مباشرة للبيئة ، وتواجه باستمرار المستضدات الأجنبية ، بما في ذلك مستضدات الطعام والميكروبات. يعد الحفاظ على سلامة الحاجز الظهاري أمرا بالغ الأهمية للوقاية من العدوى وتجنب الالتهاب الناجم عن المستضدات المشتقة من الغذاء غير الضارة. توفر هذه المقالة بروتوكولات مبسطة لتوليد عضويات المريء البشرية وثقافات واجهة الهواء السائل من خزعات المريض لدراسة المقصورة الظهارية للمريء في سياق توازن الأنسجة والمرض. كانت هذه البروتوكولات معالم علمية مهمة في العقد الماضي ، حيث وصفت الهياكل الشبيهة بالأعضاء ثلاثية الأبعاد من الخلايا الأولية المشتقة من المريض ، والمواد العضوية ، وثقافات واجهة الهواء والسائل. إنها توفر إمكانية التحقيق في وظيفة السيتوكينات المحددة وعوامل النمو ومسارات الإشارات في ظهارة المريء في إطار ثلاثي الأبعاد مع الحفاظ على الخصائص الظاهرية والجينية للمتبرع. توفر المواد العضوية معلومات عن العمارة المجهرية للأنسجة من خلال تقييم النسخ والبروتين بعد تحفيز السيتوكين. في المقابل ، تسمح ثقافات واجهة الهواء السائل بتقييم سلامة الحاجز الظهاري من خلال المقاومة عبر الظهارة (TEER) أو قياسات تدفق الجزيئات. يعد الجمع بين هذه الكائنات العضوية وثقافات واجهة الهواء السائل أداة قوية لتطوير البحث في ظروف الحاجز الظهاري المريئي الضعيف.

Esophageal inflammation compromises the epithelial barrier integrity1,2,3,4,5, as observed in eosinophilic esophagitis (EoE), a Th2-dominated chronic inflammatory disease of the esophagus6. EoE was first described in the 1990s7,8 and is predominantly induced by food antigens9,10,11,12,13. The most frequently occurring symptoms of EoE in the adult population are dysphagia and food impaction14. In children, EoE typically manifests with failure to thrive, food refusal, vomiting, and abdominal pain15. Genome-wide association studies (GWAS) have identified EoE risk genes involved in epithelial barrier integrity, moving the epithelium into the focus of EoE research16,17,18. EoE transcriptomics further revealed that an impaired differentiation process and a reactive basal zone hyperplasia cause the compromised barrier function of the esophageal epithelium3,5,19,20,21,22. The early understanding of EoE being a Th2-mediated disease6 led to the discovery of IL-13 as a driving mediator by disturbing epithelial integrity3,4,21,23. Experimental systems allowing the dissection of cytokine-mediated effects on epithelial integrity from intrinsic barrier impairment through genetic predisposition provide the possibility to study the complex interplay between immune cells and the epithelium in EoE. Human esophageal organoids and air-liquid interface (ALI) cultures have been proposed as valuable tools to analyze the consequence of cytokine stimulation on epithelial integrity5.
The first protocol for generating adult tissue-specific stem cell (ASC)-derived esophageal organoids was established five years after the first published reports of intestinal organoids in 2009 using intestinal Lgr5+ ASCs recapitulating the epithelial compartment of the small intestine24. DeWard et al. pioneered generating organoids from murine esophageal epithelial cells25. In 2018, Kasagi et al. generated human esophageal organoids from the immortalized human esophageal squamous epithelium cell line EPC2-hTERT and primary patient-derived cells26. In the same year, Zhang et al. successfully generated induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived esophageal organoids. They delineated the significance of TGF&#946; and bone morphogenetic protein (BMP) inhibition for esophageal progenitor cell (EPC) development and the crucial role of Notch signaling in the differentiation of the stratified squamous epithelium26,27. Trisno and colleagues complemented these findings by identifying Sox2 as a Wnt inhibitor that directs the developmental fate towards esophageal differentiation28. The subsequent refinements of protocols, medium composition, and culture conditions increased the organoid formation rate and made subculturing and recovering organoids after cryopreservation possible26,29,30,31,32. Although these organoids are powerful tools for studying tissue architecture and expression of potential target genes after stimulation with cytokines, esophageal organoids will not offer the possibility to measure transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux as direct measures for barrier integrity. As previously described by Sherrill and colleagues22, ALI cultures modeling epithelial differentiation4&#160;allow direct assessments of epithelial integrity. Combining patient-derived organoids and ALI cultures is a powerful tool for investigating tissue architecture and epithelial barrier integrity in EoE.
Here are procedures with instructions for isolating viable cells from esophageal biopsies and establishing esophageal organoid and ALI cultures that can further be used to study the effects of cytokines on barrier integrity.

تسليط الضوء على المؤلف: التحقيق في الفيزيولوجيا المرضية لالتهاب المريء اليوزيني

نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد للتحقيق في الحاجز الظهاري في التهاب المريء اليوزيني 

We are investigating the pathophysiology of eosinophilic esophagitis and trying to unravel the inflammatory cascade inducing and promoting the chronic inflammatory process of EOE. The identification of new immune mediators that contribute to the disease pathogenesis centered around the impairment of epithelial barrier and the approval of therapeutic antibodies against said immune mediators. We have identified the IL-20 subfamily cytokines as inflammatory mediators that impair epithelial differentiation and keratinization resulting in epithelial barrier impairment via the MAP kinase pathway.

ستنمو عضويات المريء من الخلايا الأولية المستخرجة من خزعات المريض وفقا لتعليمات البروتوكول المقدم ، كما هو موثق باستخدام مجهر برايت فيلد المقلوب (الشكل 1). تبدأ ASCs الظهارية في تكوين مجموعات الخلايا بطريقة ذاتية التنظيم خلال اليومين الأولين من الثقافة بعد بذر الخلايا المعز?...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis at JoVE.com

هنا ، يتم توفير بروتوكول لثقافة عضويات المريء البشري وثقافة واجهة الهواء السائل. يمكن استخدام ثقافة واجهة الهواء السائل لعضويات المريء لدراسة تأثير السيتوكينات على الحاجز الظهاري المريئي.

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

نحن نحقق في الفيزيولوجيا المرضية لالتهاب المريء اليوزيني ونحاول كشف الشلال الالتهابي الذي يحفز ويعزز العملية الالتهابية المزمنة ل EOE. تحديد وسطاء المناعة الجدد الذين يساهمون في التسبب في المرض يتمحور حول ضعف الحاجز الظهاري والموافقة على الأجسام المضادة العلاجية ضد الوسطاء المناعيين المذكورين. لقد حددنا السيتوكينات الفرعية IL-20 كوسطاء التهابيين يضعفون التمايز الظهاري والتقرن مما يؤدي إلى ضعف الحاجز الظهاري عبر مسار كيناز MAP.

نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد للتحقيق في الحاجز الظهاري في التهاب المريء اليوزيني

Abstract