SNSF-bevillingen 310030_219210 til J.H.N. støttede udgivelsen af dette manuskript uden begrænsninger. Figur 1 er blevet til ved hjælp af BioRender.com.

Procedurerne blev godkendt af den etiske komité i det nordvestlige og centrale Schweiz (EKNZ; Projekt-ID 2019-00273). Alle patienter gav skriftligt informeret samtykke til eksperimentel brug af biopsier før den endoskopiske undersøgelse. De reagenser og det udstyr, der blev brugt i undersøgelsen, er angivet i materialetabellen.
1. Celleisolering for patientafledte esophageal organoider
BEMÆRK: En liste over de mellemste bestandde...

Humane spiserørsorganoider og luft-væske-grænsefladekulturprotokoller

De medfølgende procedurer tillader dyrkning af patientafledte organoider og ALI-kulturer med store udsigter til succes. Organoidprotokollen er blevet tilpasset fra den første offentliggjorte protokol, der rapporterer om genereringen af humane esophageal organoider26 og fra en nyligt offentliggjort protokol32. Sherill og kolleger har beskrevet ALI-model22. Organoider og ALI-dyrkningsmodeller hjælper hinanden med at studere virkningen af cytokiner o...

Esophageal inflammation kompromitterer epitelbarrierens integritet 1,2,3,4,5, som observeret ved eosinofil øsofagitis (EoE), en Th2-domineret kronisk inflammatorisk sygdom i spiserøret 6. EoE blev først beskrevet i 1990'erne 7,8 og er overvejende induceret af fødevareantigener 9,10,11,12,13. De hyppigst forekommende symptomer på EoE i den voksne befolkning er dysfagi og fødevarepåvirkning14. Hos børn manifesterer EoE sig typisk med manglende trivsel, madnægtelse, opkastning og mavesmerter15. Genom-wide association studies (GWAS) har identificeret EoE-risikogener involveret i epitelbarriereintegritet, hvilket flytter epitelet ind i fokus for EoE-forskning 16,17,18. EoE-transkriptomics afslørede yderligere, at en nedsat differentieringsproces og en reaktiv basalzonehyperplasi forårsager den kompromitterede barrierefunktion af spiserørepitelet 3,5,19,20,21,22. Den tidlige forståelse af, at EoE er en Th2-medieret sygdom6 førte til opdagelsen af IL-13 som en drivende mediator ved at forstyrre epitelintegriteten 3,4,21,23. Eksperimentelle systemer, der tillader dissektion af cytokinmedierede virkninger på epitelintegritet fra iboende barrieresvækkelse gennem genetisk disposition, giver mulighed for at studere det komplekse samspil mellem immunceller og epitelet i EoE. Humane esophageal organoider og luft-væske interface (ALI) kulturer er blevet foreslået som værdifulde værktøjer til at analysere konsekvensen af cytokinstimulering på epitelintegritet5.
Den første protokol til generering af voksne vævsspecifikke stamceller (ASC)-afledte esophageale organoider blev etableret fem år efter de første offentliggjorte rapporter om tarmorganoider i 2009 ved hjælp af intestinale Lgr5+ ASC'er, der rekapitulerer epitelrummet i tyndtarmen24. DeWard et al. var banebrydende for at generere organoider fra murine esophageal epitelceller25. I 2018 genererede Kasagi et al. humane esophageal organoider fra den udødeliggjorte humane esophageal squamous epitel-cellelinje EPC2-hTERT og primære patientafledte celler26. Samme år genererede Zhang et al. med succes inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte esophageal organoider. De afgrænsede betydningen af TGFβ og knoglemorfogenetiske proteinhæmninger (BMP) for udvikling af esophageal progenitor cell (EPC) og den afgørende rolle af Notch-signalering i differentieringen af det stratificerede pladeepitel26,27. Trisno og kolleger supplerede disse resultater ved at identificere Sox2 som en Wnt-hæmmer, der leder udviklingsskæbnen mod esophageal differentiering28. De efterfølgende forbedringer af protokoller, mediesammensætning og dyrkningsbetingelser øgede organoiddannelseshastigheden og gjorde subkulturering og genvinding af organoider efter kryokonservering mulig 26,29,30,31,32. Selvom disse organoider er kraftfulde værktøjer til at studere vævsarkitektur og ekspression af potentielle målgener efter stimulering med cytokiner, vil esophageal organoider ikke give mulighed for at måle transepitelresistens (TEER) eller makromolekyleflux som direkte mål for barriereintegritet. Som tidligere beskrevet af Sherrill og kolleger22, tillader ALI-kulturer, der modellerer epiteldifferentiering4, direkte vurderinger af epitelintegritet. Kombinationen af patientafledte organoider og ALI-kulturer er et kraftfuldt værktøj til at undersøge vævsarkitektur og epitelbarriereintegritet i EoE.
Her er procedurer med instruktioner til isolering af levedygtige celler fra esophageal biopsier og etablering af esophageal organoid og ALI-kulturer, der yderligere kan bruges til at studere virkningerne af cytokiner på barriereintegritet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainer</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3945.070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pituitary extract</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>7.657 185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>3532-010-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline&#160; (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVE-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell counting slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>FD4</td>
			<td>average mol wt 3000-5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus - Megafuge&#160; 40R&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant epidermal growth factor</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein</td>
			<td>R&amp;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>251-KG-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 100-1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 20-200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td></td>
			<td>1134950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T9128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>SAFC Biosciences (Merck)</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris (Bio-Techne)</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional cell culture models to investigate the epithelial barrier in eosinophilic esophagitis 

Spiserørets pladeepitel er direkte udsat for miljøet og står konstant over for fremmede antigener, herunder fødevareantigener og mikrober. Opretholdelse af epitelbarrierens integritet er afgørende for at forhindre infektioner og undgå betændelse forårsaget af harmløse fødevareafledte antigener. Denne artikel giver forenklede protokoller til generering af humane esophageal organoider og luft-væske-grænsefladekulturer fra patientbiopsier for at studere epitelrummet i spiserøret i forbindelse med vævshomeostase og sygdom. Disse protokoller har været vigtige videnskabelige milepæle i det sidste årti, der beskriver tredimensionelle organlignende strukturer fra patientafledte primære celler, organoider og luft-væske-grænsefladekulturer. De giver mulighed for at undersøge funktionen af specifikke cytokiner, vækstfaktorer og signalveje i spiserørets epitel inden for en tredimensionel ramme, samtidig med at donorens fænotypiske og genetiske egenskaber opretholdes. Organoider giver information om vævsmikroarkitektur ved at vurdere transkriptomet og proteomet efter cytokinstimulering. I modsætning hertil tillader luft-væske-grænsefladekulturer vurdering af epitelbarrierens integritet gennem transepitelmodstand (TEER) eller makromolekylefluxmålinger. Kombinationen af disse organoider og luft-væske-grænsefladekulturer er et kraftfuldt værktøj til at fremme forskning i nedsatte esophageal epitelbarrieretilstande.

Esophageal inflammation compromises the epithelial barrier integrity1,2,3,4,5, as observed in eosinophilic esophagitis (EoE), a Th2-dominated chronic inflammatory disease of the esophagus6. EoE was first described in the 1990s7,8 and is predominantly induced by food antigens9,10,11,12,13. The most frequently occurring symptoms of EoE in the adult population are dysphagia and food impaction14. In children, EoE typically manifests with failure to thrive, food refusal, vomiting, and abdominal pain15. Genome-wide association studies (GWAS) have identified EoE risk genes involved in epithelial barrier integrity, moving the epithelium into the focus of EoE research16,17,18. EoE transcriptomics further revealed that an impaired differentiation process and a reactive basal zone hyperplasia cause the compromised barrier function of the esophageal epithelium3,5,19,20,21,22. The early understanding of EoE being a Th2-mediated disease6 led to the discovery of IL-13 as a driving mediator by disturbing epithelial integrity3,4,21,23. Experimental systems allowing the dissection of cytokine-mediated effects on epithelial integrity from intrinsic barrier impairment through genetic predisposition provide the possibility to study the complex interplay between immune cells and the epithelium in EoE. Human esophageal organoids and air-liquid interface (ALI) cultures have been proposed as valuable tools to analyze the consequence of cytokine stimulation on epithelial integrity5.
The first protocol for generating adult tissue-specific stem cell (ASC)-derived esophageal organoids was established five years after the first published reports of intestinal organoids in 2009 using intestinal Lgr5+ ASCs recapitulating the epithelial compartment of the small intestine24. DeWard et al. pioneered generating organoids from murine esophageal epithelial cells25. In 2018, Kasagi et al. generated human esophageal organoids from the immortalized human esophageal squamous epithelium cell line EPC2-hTERT and primary patient-derived cells26. In the same year, Zhang et al. successfully generated induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived esophageal organoids. They delineated the significance of TGF&#946; and bone morphogenetic protein (BMP) inhibition for esophageal progenitor cell (EPC) development and the crucial role of Notch signaling in the differentiation of the stratified squamous epithelium26,27. Trisno and colleagues complemented these findings by identifying Sox2 as a Wnt inhibitor that directs the developmental fate towards esophageal differentiation28. The subsequent refinements of protocols, medium composition, and culture conditions increased the organoid formation rate and made subculturing and recovering organoids after cryopreservation possible26,29,30,31,32. Although these organoids are powerful tools for studying tissue architecture and expression of potential target genes after stimulation with cytokines, esophageal organoids will not offer the possibility to measure transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux as direct measures for barrier integrity. As previously described by Sherrill and colleagues22, ALI cultures modeling epithelial differentiation4&#160;allow direct assessments of epithelial integrity. Combining patient-derived organoids and ALI cultures is a powerful tool for investigating tissue architecture and epithelial barrier integrity in EoE.
Here are procedures with instructions for isolating viable cells from esophageal biopsies and establishing esophageal organoid and ALI cultures that can further be used to study the effects of cytokines on barrier integrity.

Forfatter Spotlight: Undersøgelse af patofysiologien af eosinofil øsofagitis

Tredimensionelle cellekulturmodeller til undersøgelse af epitelbarrieren ved eosinofil øsofagitis 

We are investigating the pathophysiology of eosinophilic esophagitis and trying to unravel the inflammatory cascade inducing and promoting the chronic inflammatory process of EOE. The identification of new immune mediators that contribute to the disease pathogenesis centered around the impairment of epithelial barrier and the approval of therapeutic antibodies against said immune mediators. We have identified the IL-20 subfamily cytokines as inflammatory mediators that impair epithelial differentiation and keratinization resulting in epithelial barrier impairment via the MAP kinase pathway.

Esophageal organoider vil vokse fra primære celler ekstraheret fra patientbiopsier i henhold til instruktionerne i den medfølgende protokol, som dokumenteret med et omvendt brightfield-mikroskop (figur 1). Epiteliale ASC'er begynder at danne celleklynger på en selvorganiserende måde inden for de første to dage af dyrkningen efter såning af de isolerede celler i basalmembranekstraktet, der fungerer som et stillads. Størrelsen og antallet af celleklynger, der kan ses med et omvendt lysf...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis at JoVE.com

Her er der tilvejebragt en protokol for dyrkning af humane esophageal organoider og luft-væske-grænsefladekultur. Esophageal organoiders luft-væske-grænsefladekultur kan bruges til at studere virkningen af cytokiner på esophageal epitelbarriere.

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

Vi undersøger patofysiologien af eosinofil øsofagitis og forsøger at optrevle den inflammatoriske kaskade, der inducerer og fremmer den kroniske inflammatoriske proces af EOE. Identifikationen af nye immunmediatorer, der bidrager til sygdomspatogenesen, er centreret omkring svækkelsen af epitelbarrieren og godkendelsen af terapeutiske antistoffer mod nævnte immunmediatorer. Vi har identificeret IL-20-underfamiliens cytokiner som inflammatoriske mediatorer, der forringer epiteldifferentiering og keratinisering, hvilket resulterer i svækkelse af epitelbarrieren via MAP-kinasevejen.

Tredimensionelle cellekulturmodeller til undersøgelse af epitelbarrieren ved eosinofil øsofagitis

Abstract