De SNSF-subsidie 310030_219210 aan J.H.N. ondersteunde de publicatie van dit manuscript zonder beperkingen. Figuur 1 is tot stand gekomen met behulp van BioRender.com.

De procedures werden goedgekeurd door de ethische commissie van Noordwest- en Centraal-Zwitserland (EKNZ; Project-ID 2019-00273). Alle patiënten gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voor het experimentele gebruik van biopsieën vóór het endoscopisch onderzoek. De reagentia en apparatuur die in het onderzoek worden gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Celisolatie voor slokdarmorganoïden van patiënten
OPMERKIN...

Menselijke slokdarmorganoïden en lucht-vloeistof-interfacecultuurprotocollen

De aangeboden procedures maken het mogelijk om van patiënten afgeleide organoïden en ALI-culturen te kweken met een hoge kans op succes. Het organoïdenprotocol is aangepast van het eerste gepubliceerde protocol dat de generatie van menselijke slokdarmorganoïden rapporteert26 en van een recent gepubliceerd protocol32. Sherill en collega's hebben het ALI-model22 beschreven. Organoïden en ALI-kweekmodellen helpen elkaar bij het bestuderen van de im...

Slokdarmontsteking brengt de integriteit van de epitheelbarrièrein gevaar 1,2,3,4,5, zoals waargenomen bij eosinofiele oesofagitis (EoE), een door Th2 gedomineerde chronische ontstekingsziekte van de slokdarm 6. EoE werd voor het eerst beschreven inde jaren 1990 7,8 en wordt voornamelijk geïnduceerd door voedselantigenen 9,10,11,12,13. De meest voorkomende symptomen van EoE bij de volwassen bevolking zijn dysfagie en voedselimpactie14. Bij kinderen manifesteert EoE zich meestal met groeiachterstand, voedselweigering, braken en buikpijn15. Genoomwijde associatiestudies (GWAS) hebben EoE-risicogenen geïdentificeerd die betrokken zijn bij de integriteit van de epitheliale barrière, waardoor het epitheel in de focus van EoE-onderzoek is komen te staan 16,17,18. EoE-transcriptomics toonden verder aan dat een verstoord differentiatieproces en een reactieve hyperplasie van de basale zone de aangetaste barrièrefunctie van het slokdarmepitheel veroorzaken 3,5,19,20,21,22. Het vroege begrip dat EoE een Th2-gemedieerde ziekte is6 leidde tot de ontdekking van IL-13 als een drijvende mediator door de epitheliale integriteit te verstoren 3,4,21,23. Experimentele systemen die het mogelijk maken om cytokine-gemedieerde effecten op de epitheelintegriteit te ontleden van intrinsieke barrièrestoornissen door genetische predispositie, bieden de mogelijkheid om het complexe samenspel tussen immuuncellen en het epitheel in EoE te bestuderen. Menselijke slokdarmorganoïden en lucht-vloeistof-interface (ALI)-culturen zijn voorgesteld als waardevolle hulpmiddelen om de gevolgen van cytokinestimulatie op de epitheelintegriteit te analyseren.
Het eerste protocol voor het genereren van van volwassen weefselspecifieke stamcellen (ASC) afgeleide slokdarmorganoïden werd vijf jaar na de eerste gepubliceerde rapporten van darmorganoïden in 2009 vastgesteld met behulp van intestinale Lgr5+ ASC's die het epitheelcompartiment van de dunne darm recapituleerden24. DeWard et al. waren pioniers op het gebied van het genereren van organoïden uit slokdarmepitheelcellen van muizen25. In 2018 genereerden Kasagi et al. menselijke slokdarmorganoïden uit de onsterfelijke menselijke plaveiselepitheelcellijn EPC2-hTERT en primaire van patiënten afgeleide cellen26. In hetzelfde jaar genereerden Zhang et al. met succes geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) afgeleide slokdarmorganoïden. Ze schetsten het belang van remming van TGFβ en botmorfogenetisch eiwit (BMP) voor de ontwikkeling van slokdarmvoorlopercellen (EPC) en de cruciale rol van Notch-signalering bij de differentiatie van het gestratificeerde plaveiselepitheel26,27. Trisno en collega's vulden deze bevindingen aan door Sox2 te identificeren als een Wnt-remmer die het ontwikkelingslot richt op slokdarmdifferentiatie28. De daaropvolgende verfijningen van protocollen, mediumsamenstelling en kweekomstandigheden verhoogden de vormingssnelheid van organoïden en maakten subcultuur en herstel van organoïden na cryopreservatie mogelijk 26,29,30,31,32. Hoewel deze organoïden krachtige instrumenten zijn voor het bestuderen van weefselarchitectuur en expressie van potentiële doelgenen na stimulatie met cytokines, zullen slokdarmorganoïden niet de mogelijkheid bieden om transepitheliale weerstand (TEER) of macromolecuulflux te meten als directe metingen voor barrière-integriteit. Zoals eerder beschreven door Sherrill en collega's22, maken ALI-culturen die epitheliale differentiatiemodelleren 4 directe beoordelingen van de epitheliale integriteit mogelijk. Het combineren van van patiënten afgeleide organoïden en ALI-culturen is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van weefselarchitectuur en integriteit van de epitheliale barrière in EoE.
Hier zijn procedures met instructies voor het isoleren van levensvatbare cellen uit slokdarmbiopsieën en het opzetten van slokdarmorganoïde- en ALI-culturen die verder kunnen worden gebruikt om de effecten van cytokinen op de integriteit van de barrière te bestuderen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainer</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3945.070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pituitary extract</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>7.657 185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>3532-010-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline&#160; (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVE-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell counting slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>FD4</td>
			<td>average mol wt 3000-5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus - Megafuge&#160; 40R&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant epidermal growth factor</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein</td>
			<td>R&amp;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>251-KG-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 100-1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 20-200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td></td>
			<td>1134950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T9128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>SAFC Biosciences (Merck)</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris (Bio-Techne)</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional cell culture models to investigate the epithelial barrier in eosinophilic esophagitis 

Het plaveiselepitheel van de slokdarm wordt direct blootgesteld aan de omgeving en wordt continu geconfronteerd met vreemde antigenen, waaronder voedselantigenen en microben. Het handhaven van de integriteit van de epitheelbarrière is van cruciaal belang voor het voorkomen van infecties en het voorkomen van ontstekingen veroorzaakt door onschadelijke van voedsel afgeleide antigenen. Dit artikel biedt vereenvoudigde protocollen voor het genereren van menselijke slokdarmorganoïden en lucht-vloeistofinterfaceculturen uit biopsieën van patiënten om het epitheelcompartiment van de slokdarm te bestuderen in de context van weefselhomeostase en ziekte. Deze protocollen zijn in het afgelopen decennium belangrijke wetenschappelijke mijlpalen geweest en beschrijven driedimensionale orgaanachtige structuren van van patiënten afgeleide primaire cellen, organoïden en lucht-vloeistofinterfaceculturen. Ze bieden de mogelijkheid om de functie van specifieke cytokines, groeifactoren en signaalroutes in het slokdarmepitheel te onderzoeken binnen een driedimensionaal kader met behoud van de fenotypische en genetische eigenschappen van de donor. Organoïden geven informatie over weefselmicroarchitectuur door het transcriptoom en proteoom na cytokinestimulatie te beoordelen. Lucht-vloeistof-interfaceculturen daarentegen maken de beoordeling van de integriteit van de epitheliale barrière mogelijk door middel van transepitheliale weerstand (TEER) of macromolecuulfluxmetingen. Het combineren van deze organoïden en lucht-vloeistof-interfaceculturen is een krachtig hulpmiddel om onderzoek naar verminderde slokdarmepitheliale barrièrecondities te bevorderen.

Esophageal inflammation compromises the epithelial barrier integrity1,2,3,4,5, as observed in eosinophilic esophagitis (EoE), a Th2-dominated chronic inflammatory disease of the esophagus6. EoE was first described in the 1990s7,8 and is predominantly induced by food antigens9,10,11,12,13. The most frequently occurring symptoms of EoE in the adult population are dysphagia and food impaction14. In children, EoE typically manifests with failure to thrive, food refusal, vomiting, and abdominal pain15. Genome-wide association studies (GWAS) have identified EoE risk genes involved in epithelial barrier integrity, moving the epithelium into the focus of EoE research16,17,18. EoE transcriptomics further revealed that an impaired differentiation process and a reactive basal zone hyperplasia cause the compromised barrier function of the esophageal epithelium3,5,19,20,21,22. The early understanding of EoE being a Th2-mediated disease6 led to the discovery of IL-13 as a driving mediator by disturbing epithelial integrity3,4,21,23. Experimental systems allowing the dissection of cytokine-mediated effects on epithelial integrity from intrinsic barrier impairment through genetic predisposition provide the possibility to study the complex interplay between immune cells and the epithelium in EoE. Human esophageal organoids and air-liquid interface (ALI) cultures have been proposed as valuable tools to analyze the consequence of cytokine stimulation on epithelial integrity5.
The first protocol for generating adult tissue-specific stem cell (ASC)-derived esophageal organoids was established five years after the first published reports of intestinal organoids in 2009 using intestinal Lgr5+ ASCs recapitulating the epithelial compartment of the small intestine24. DeWard et al. pioneered generating organoids from murine esophageal epithelial cells25. In 2018, Kasagi et al. generated human esophageal organoids from the immortalized human esophageal squamous epithelium cell line EPC2-hTERT and primary patient-derived cells26. In the same year, Zhang et al. successfully generated induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived esophageal organoids. They delineated the significance of TGF&#946; and bone morphogenetic protein (BMP) inhibition for esophageal progenitor cell (EPC) development and the crucial role of Notch signaling in the differentiation of the stratified squamous epithelium26,27. Trisno and colleagues complemented these findings by identifying Sox2 as a Wnt inhibitor that directs the developmental fate towards esophageal differentiation28. The subsequent refinements of protocols, medium composition, and culture conditions increased the organoid formation rate and made subculturing and recovering organoids after cryopreservation possible26,29,30,31,32. Although these organoids are powerful tools for studying tissue architecture and expression of potential target genes after stimulation with cytokines, esophageal organoids will not offer the possibility to measure transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux as direct measures for barrier integrity. As previously described by Sherrill and colleagues22, ALI cultures modeling epithelial differentiation4&#160;allow direct assessments of epithelial integrity. Combining patient-derived organoids and ALI cultures is a powerful tool for investigating tissue architecture and epithelial barrier integrity in EoE.
Here are procedures with instructions for isolating viable cells from esophageal biopsies and establishing esophageal organoid and ALI cultures that can further be used to study the effects of cytokines on barrier integrity.

Auteur in de schijnwerpers: onderzoek naar de pathofysiologie van eosinofiele oesofagitis

Driedimensionale celkweekmodellen om de epitheelbarrière bij eosinofiele oesofagitis te onderzoeken 

We are investigating the pathophysiology of eosinophilic esophagitis and trying to unravel the inflammatory cascade inducing and promoting the chronic inflammatory process of EOE. The identification of new immune mediators that contribute to the disease pathogenesis centered around the impairment of epithelial barrier and the approval of therapeutic antibodies against said immune mediators. We have identified the IL-20 subfamily cytokines as inflammatory mediators that impair epithelial differentiation and keratinization resulting in epithelial barrier impairment via the MAP kinase pathway.

Slokdarmorganoïden zullen groeien uit primaire cellen die zijn geëxtraheerd uit biopsieën van patiënten volgens de instructies van het meegeleverde protocol, zoals gedocumenteerd met een omgekeerde helderveldmicroscoop (Figuur 1). Epitheliale ASC's beginnen binnen de eerste twee dagen van de kweek op een zelforganiserende manier celclusters te vormen na het zaaien van de geïsoleerde cellen in het basaalmembraanextract, dat als steiger dient. De grootte en het aantal celclusters, waarnee...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis at JoVE.com

Hier wordt een protocol verstrekt voor de cultuur van menselijke slokdarmorganoïden en lucht-vloeistof-interfacecultuur. De lucht-vloeistofinterfacecultuur van slokdarmorganoïden kan worden gebruikt om de impact van cytokines op de slokdarmepitheelbarrière te bestuderen.

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

We onderzoeken de pathofysiologie van eosinofiele oesofagitis en proberen de ontstekingscascade te ontrafelen die het chronische ontstekingsproces van EOE induceert en bevordert. De identificatie van nieuwe immuunmediatoren die bijdragen aan de pathogenese van de ziekte was gecentreerd rond de verslechtering van de epitheelbarrière en de goedkeuring van therapeutische antilichamen tegen genoemde immuunmediatoren. We hebben de cytokinen van de IL-20-subfamilie geïdentificeerd als inflammatoire mediatoren die de epitheeldifferentiatie en keratinisatie belemmeren, wat resulteert in stoornissen van de epitheliale barrière via de MAP-kinaseroute.

Driedimensionale celkweekmodellen om de epitheelbarrière bij eosinofiele oesofagitis te onderzoeken

Abstract