Das SNF-Stipendium 310030_219210 an J.H.N. unterstützte die Veröffentlichung dieses Manuskripts ohne Einschränkungen. Abbildung 1 wurde mit Hilfe von BioRender.com erstellt.

Die Verfahren wurden von der Ethikkommission der Nordwest- und Zentralschweiz (EKNZ; Projekt-ID 2019-00273). Alle Patienten gaben vor der endoskopischen Untersuchung eine schriftliche Einverständniserklärung für den experimentellen Einsatz von Biopsien ab. Die in der Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Zellisolierung von patienteneigenen Organoiden der Speiseröhre
ANMERKUNG: Eine L...

Protokolle für humane Ösophagus-Organoide und Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen

Die zur Verfügung gestellten Verfahren ermöglichen die Kultivierung von patientengewonnenen Organoiden und ALI-Kulturen mit hohen Erfolgsaussichten. Das Organoid-Protokoll wurde aus dem ersten veröffentlichten Protokoll, das über die Erzeugung humaner Ösophagus-Organoide berichtet26, und aus einem kürzlich veröffentlichten Protokoll32 angepasst. Sherill und Kollegen haben das ALI-Modell22 beschrieben. Organoide und ALI-Kulturmodelle unterstüt...

Eine Entzündung der Speiseröhre beeinträchtigt die Integrität der Epithelbarriere 1,2,3,4,5, wie bei der eosinophilen Ösophagitis (EoE), einer Th2-dominierten chronischen Entzündungserkrankung der Speiseröhre6, beobachtet wird. EoE wurde erstmals in den 1990er Jahren beschrieben 7,8 und wird überwiegend durch die Lebensmittelantigene 9,10,11,12,13 induziert. Die am häufigsten auftretenden Symptome von EoE in der erwachsenen Bevölkerung sind Dysphagie und Nahrungsmittelimpaktion14. Bei Kindern manifestiert sich EoE typischerweise mit Gedeihstörungen, Nahrungsverweigerung, Erbrechen und Bauchschmerzen15. Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben EoE-Risikogene identifiziert, die an der Integrität der Epithelbarriere beteiligt sind, wodurch das Epithel in den Fokus der EoE-Forschung gerücktist 16,17,18. Die EoE-Transkriptomik zeigte weiterhin, dass ein gestörter Differenzierungsprozess und eine reaktive Basalzonenhyperplasie die beeinträchtigte Barrierefunktion des Ösophagepithels verursachen 3,5,19,20,21,22. Das frühe Verständnis, dass EoE eine Th2-vermittelte Erkrankungist 6, führte zur Entdeckung von IL-13 als treibender Mediator durch Störung der epithelialen Integrität 3,4,21,23. Experimentelle Systeme, die es ermöglichen, Zytokin-vermittelte Effekte auf die Epithelintegrität von intrinsischen Barrierebeeinträchtigungen durch genetische Prädisposition zu disparieren, bieten die Möglichkeit, das komplexe Zusammenspiel zwischen Immunzellen und Epithel in EoE zu untersuchen. Humane Ösophagus-Organoide und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen (ALI) wurden als wertvolle Werkzeuge vorgeschlagen, um die Auswirkungen der Zytokinstimulation auf die epitheliale Integrität zu analysieren5.
Das erste Protokoll zur Generierung adulter gewebespezifischer Stammzellen (ASC)-abgeleiteter Ösophagus-Organoide wurde fünf Jahre nach den ersten veröffentlichten Berichten über Darmorganoide im Jahr 2009 etabliert, bei denen intestinale Lgr5+-ASCs verwendet wurden, die das Epithelkompartiment des Dünndarms rekapitulieren24. DeWard et al. leisteten Pionierarbeit bei der Erzeugung von Organoiden aus murinen Ösophagus-Epithelzellen25. Im Jahr 2018 erzeugten Kasagi et al. humane Ösophagus-Organoide aus der immortalisierten humanen Plattenepithelzelllinie EPC2-hTERT und primären patienteneigenen Zellen26. Im selben Jahr gelang es Zhang et al., aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete Organoide der Speiseröhre zu erzeugen. Sie skizzierten die Bedeutung der Hemmung von TGFβ und knochenmorphogenetischem Protein (BMP) für die Entwicklung von Vorläuferzellen der Speiseröhre (EPC) und die entscheidende Rolle des Notch-Signalwegs bei der Differenzierung des geschichteten Plattenepithels26,27. Trisno und Kollegen ergänzten diese Befunde, indem sie Sox2 als Wnt-Inhibitor identifizierten, der das Entwicklungsschicksal in Richtung Ösophagusdifferenzierung lenkt28. Die anschließende Verfeinerung der Protokolle, der Zusammensetzung des Mediums und der Kulturbedingungen erhöhte die Organoidbildungsrate und ermöglichte die Subkultivierung und Rückgewinnung von Organoiden nach der Kryokonservierung 26,29,30,31,32. Obwohl diese Organoide leistungsfähige Werkzeuge für die Untersuchung der Gewebearchitektur und der Expression potenzieller Zielgene nach Stimulation mit Zytokinen sind, bieten Organoide der Speiseröhre nicht die Möglichkeit, den transepithelialen Widerstand (TEER) oder den Makromolekülfluss als direkte Messungen für die Barriereintegrität zu messen. Wie zuvor von Sherrill und Kollegen22 beschrieben, ermöglichen ALI-Kulturen, die die epitheliale Differenzierung4 modellieren, eine direkte Beurteilung der epithelialen Integrität. Die Kombination von patienteneigenen Organoiden und ALI-Kulturen ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Gewebearchitektur und der Integrität der Epithelbarriere bei EoE.
Hier finden Sie Verfahren mit Anweisungen zur Isolierung lebensfähiger Zellen aus Ösophagusbiopsien und zur Etablierung von Organoid- und ALI-Kulturen der Speiseröhre, die weiter verwendet werden können, um die Auswirkungen von Zytokinen auf die Integrität der Barriere zu untersuchen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainer</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3945.070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pituitary extract</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>7.657 185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>3532-010-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline&#160; (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVE-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell counting slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>FD4</td>
			<td>average mol wt 3000-5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus - Megafuge&#160; 40R&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant epidermal growth factor</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein</td>
			<td>R&amp;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>251-KG-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 100-1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 20-200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td></td>
			<td>1134950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T9128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>SAFC Biosciences (Merck)</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris (Bio-Techne)</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional cell culture models to investigate the epithelial barrier in eosinophilic esophagitis 

Das Plattenepithel der Speiseröhre ist direkt der Umwelt ausgesetzt und ständig fremden Antigenen, einschließlich Lebensmittelantigenen und Mikroben, ausgesetzt. Die Aufrechterhaltung der Integrität der Epithelbarriere ist entscheidend für die Vorbeugung von Infektionen und die Vermeidung von Entzündungen, die durch harmlose Antigene aus der Nahrung verursacht werden. Dieser Artikel enthält vereinfachte Protokolle für die Generierung von humanen Organoiden der Speiseröhre und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen aus Patientenbiopsien, um das epitheliale Kompartiment der Speiseröhre im Zusammenhang mit Gewebehomöostase und -krankheit zu untersuchen. Diese Protokolle waren in den letzten zehn Jahren bedeutende wissenschaftliche Meilensteine und beschreiben dreidimensionale organähnliche Strukturen aus patientengewonnenen Primärzellen, Organoiden und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen. Sie bieten die Möglichkeit, die Funktion spezifischer Zytokine, Wachstumsfaktoren und Signalwege im Ösophagepithel in einem dreidimensionalen Rahmen unter Beibehaltung der phänotypischen und genetischen Eigenschaften des Spenders zu untersuchen. Organoide liefern Informationen über die Mikroarchitektur des Gewebes, indem sie das Transkriptom und Proteom nach Zytokinstimulation bewerten. Im Gegensatz dazu ermöglichen Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen die Beurteilung der Integrität der epithelialen Barriere durch Messungen des transepithelialen Widerstands (TEER) oder des Makromolekülflusses. Die Kombination dieser Organoide und Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Forschung zu beeinträchtigten Bedingungen der epithelialen Barriere der Speiseröhre voranzutreiben.

Esophageal inflammation compromises the epithelial barrier integrity1,2,3,4,5, as observed in eosinophilic esophagitis (EoE), a Th2-dominated chronic inflammatory disease of the esophagus6. EoE was first described in the 1990s7,8 and is predominantly induced by food antigens9,10,11,12,13. The most frequently occurring symptoms of EoE in the adult population are dysphagia and food impaction14. In children, EoE typically manifests with failure to thrive, food refusal, vomiting, and abdominal pain15. Genome-wide association studies (GWAS) have identified EoE risk genes involved in epithelial barrier integrity, moving the epithelium into the focus of EoE research16,17,18. EoE transcriptomics further revealed that an impaired differentiation process and a reactive basal zone hyperplasia cause the compromised barrier function of the esophageal epithelium3,5,19,20,21,22. The early understanding of EoE being a Th2-mediated disease6 led to the discovery of IL-13 as a driving mediator by disturbing epithelial integrity3,4,21,23. Experimental systems allowing the dissection of cytokine-mediated effects on epithelial integrity from intrinsic barrier impairment through genetic predisposition provide the possibility to study the complex interplay between immune cells and the epithelium in EoE. Human esophageal organoids and air-liquid interface (ALI) cultures have been proposed as valuable tools to analyze the consequence of cytokine stimulation on epithelial integrity5.
The first protocol for generating adult tissue-specific stem cell (ASC)-derived esophageal organoids was established five years after the first published reports of intestinal organoids in 2009 using intestinal Lgr5+ ASCs recapitulating the epithelial compartment of the small intestine24. DeWard et al. pioneered generating organoids from murine esophageal epithelial cells25. In 2018, Kasagi et al. generated human esophageal organoids from the immortalized human esophageal squamous epithelium cell line EPC2-hTERT and primary patient-derived cells26. In the same year, Zhang et al. successfully generated induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived esophageal organoids. They delineated the significance of TGF&#946; and bone morphogenetic protein (BMP) inhibition for esophageal progenitor cell (EPC) development and the crucial role of Notch signaling in the differentiation of the stratified squamous epithelium26,27. Trisno and colleagues complemented these findings by identifying Sox2 as a Wnt inhibitor that directs the developmental fate towards esophageal differentiation28. The subsequent refinements of protocols, medium composition, and culture conditions increased the organoid formation rate and made subculturing and recovering organoids after cryopreservation possible26,29,30,31,32. Although these organoids are powerful tools for studying tissue architecture and expression of potential target genes after stimulation with cytokines, esophageal organoids will not offer the possibility to measure transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux as direct measures for barrier integrity. As previously described by Sherrill and colleagues22, ALI cultures modeling epithelial differentiation4&#160;allow direct assessments of epithelial integrity. Combining patient-derived organoids and ALI cultures is a powerful tool for investigating tissue architecture and epithelial barrier integrity in EoE.
Here are procedures with instructions for isolating viable cells from esophageal biopsies and establishing esophageal organoid and ALI cultures that can further be used to study the effects of cytokines on barrier integrity.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der Pathophysiologie der eosinophilen Ösophagitis

Dreidimensionale Zellkulturmodelle zur Untersuchung der Epithelbarriere bei eosinophiler Ösophagitis 

We are investigating the pathophysiology of eosinophilic esophagitis and trying to unravel the inflammatory cascade inducing and promoting the chronic inflammatory process of EOE. The identification of new immune mediators that contribute to the disease pathogenesis centered around the impairment of epithelial barrier and the approval of therapeutic antibodies against said immune mediators. We have identified the IL-20 subfamily cytokines as inflammatory mediators that impair epithelial differentiation and keratinization resulting in epithelial barrier impairment via the MAP kinase pathway.

Organoide der Speiseröhre wachsen aus Primärzellen, die aus Patientenbiopsien gemäß den Anweisungen des bereitgestellten Protokolls extrahiert wurden, wie mit einem inversen Hellfeldmikroskop dokumentiert (Abbildung 1). Epithel-ASCs beginnen innerhalb der ersten zwei Tage der Kultur mit der selbstorganisierenden Bildung von Zellclustern, nachdem sie die isolierten Zellen in den Basalmembranextrakt eingesät haben, der als Gerüst dient. Die Größe und Anzahl der Zellcluster, die mit ein...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis at JoVE.com

Hier wird ein Protokoll für die Kultivierung von humanen Ösophagus-Organoiden und Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen bereitgestellt. Die Luft-Flüssig-Grenzflächenkultur von Ösophagus-Organoiden kann verwendet werden, um den Einfluss von Zytokinen auf die Epithelbarriere der Speiseröhre zu untersuchen.

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

Wir untersuchen die Pathophysiologie der eosinophilen Ösophagitis und versuchen, die Entzündungskaskade zu entschlüsseln, die den chronischen Entzündungsprozess der EOE induziert und fördert. Die Identifizierung neuer Immunmediatoren, die zur Krankheitspathogenese beitragen, konzentrierte sich auf die Beeinträchtigung der Epithelbarriere und die Zulassung therapeutischer Antikörper gegen diese Immunmediatoren. Wir haben die Zytokine der IL-20-Unterfamilie als Entzündungsmediatoren identifiziert, die die epitheliale Differenzierung und Keratinisierung beeinträchtigen, was zu einer Beeinträchtigung der Epithelbarriere über den MAP-Kinase-Signalweg führt.

Dreidimensionale Zellkulturmodelle zur Untersuchung der Epithelbarriere bei eosinophiler Ösophagitis

Abstract