La sovvenzione del FNS 310030_219210 a J.H.N. ha sostenuto la pubblicazione di questo manoscritto senza restrizioni. La Figura 1 è stata creata con l'aiuto di BioRender.com.

Le procedure sono state approvate dalla commissione d'etica della Svizzera nordoccidentale e centrale (EKNZ; ID progetto 2019-00273). Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto per l'uso sperimentale delle biopsie prima dell'esame endoscopico. I reagenti e le attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Isolamento cellulare per organoidi esofagei derivati da pazienti
NOTA: Un ele...

Organoidi esofagei umani e protocolli di coltura dell'interfaccia aria-liquido

Le procedure fornite consentono la coltivazione di organoidi derivati da pazienti e colture di ALI con elevate prospettive di successo. Il protocollo degli organoidi è stato adattato dal primo protocollo pubblicato che riporta la generazione di organoidi esofagei umani26 e da un protocollo32 pubblicato di recente. Sherill e colleghi hanno descritto il modello ALI22. Gli organoidi e i modelli di coltura ALI si assistono a vicenda nello studio dell'im...

L'infiammazione esofagea compromette l'integrità della barriera epiteliale 1,2,3,4,5, come osservato nell'esofagite eosinofila (EoE), una malattia infiammatoria cronica dell'esofago6-dominata da Th2. L'EoE è stata descritta per la prima volta negli anni '90 7,8 ed è prevalentemente indotta dagli antigeni alimentari 9,10,11,12,13. I sintomi più frequenti dell'EoE nella popolazione adulta sono la disfagia e l'occlusione alimentare14. Nei bambini, l'EoE si manifesta tipicamente con ritardo della crescita, rifiuto del cibo, vomito e dolore addominale15. Gli studi di associazione genomica-wide (GWAS) hanno identificato i geni di rischio EoE coinvolti nell'integrità della barriera epiteliale, spostando l'epitelio al centro della ricerca EoE 16,17,18. La trascrittomica EoE ha inoltre rivelato che un processo di differenziazione alterato e un'iperplasia reattiva della zona basale causano la compromissione della funzione di barriera dell'epitelio esofageo 3,5,19,20,21,22. La comprensione precoce del fatto che l'EoE è una malattia mediata da Th26 ha portato alla scoperta dell'IL-13 come mediatore guida disturbando l'integrità epiteliale 3,4,21,23. I sistemi sperimentali che consentono di dissecare gli effetti mediati dalle citochine sull'integrità epiteliale da compromissione intrinseca della barriera attraverso la predisposizione genetica forniscono la possibilità di studiare la complessa interazione tra le cellule immunitarie e l'epitelio nell'EoE. Gli organoidi esofagei umani e le colture di interfaccia aria-liquido (ALI) sono stati proposti come strumenti validi per analizzare le conseguenze della stimolazione delle citochine sull'integrità epiteliale5.
Il primo protocollo per la generazione di organoidi esofagei derivati da cellule staminali tessuto-specifiche (ASC) adulte è stato stabilito cinque anni dopo i primi rapporti pubblicati di organoidi intestinali nel 2009 utilizzando ASC intestinali Lgr5+ che ricapitolano il compartimento epiteliale dell'intestino tenue24. DeWard et al. sono stati i pionieri della generazione di organoidi da cellule epiteliali esofagee murine25. Nel 2018, Kasagi et al. hanno generato organoidi esofagei umani dalla linea cellulare di epitelio squamoso esofageo umano immortalizzato EPC2-hTERT e da cellule primarie derivate da pazienti26. Nello stesso anno, Zhang et al. hanno generato con successo organoidi esofagei derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Hanno delineato il significato dell'inibizione del TGFβ e della proteina morfogenetica ossea (BMP) per lo sviluppo delle cellule progenitrici esofagee (EPC) e il ruolo cruciale della segnalazione di Notch nella differenziazione dell'epitelio squamoso stratificato26,27. Trisno e colleghi hanno integrato questi risultati identificando Sox2 come un inibitore di Wnt che dirige il destino dello sviluppo verso la differenziazione esofagea28. I successivi perfezionamenti dei protocolli, della composizione del terreno e delle condizioni di coltura hanno aumentato il tasso di formazione degli organoidi e hanno reso possibile la subcoltura e il recupero degli organoidi dopo la crioconservazione 26,29,30,31,32. Sebbene questi organoidi siano potenti strumenti per studiare l'architettura tissutale e l'espressione di potenziali geni bersaglio dopo la stimolazione con citochine, gli organoidi esofagei non offrono la possibilità di misurare la resistenza transepiteliale (TEER) o il flusso di macromolecole come misure dirette per l'integrità della barriera. Come precedentemente descritto da Sherrill e colleghi22, le colture ALI che modellano la differenziazione epiteliale4 consentono valutazioni dirette dell'integrità epiteliale. La combinazione di organoidi derivati da pazienti e colture di ALI è un potente strumento per studiare l'architettura dei tessuti e l'integrità della barriera epiteliale nell'EoE.
Di seguito sono riportate le procedure con le istruzioni per isolare le cellule vitali dalle biopsie esofagee e stabilire colture di organoidi esofagei e ALI che possono essere ulteriormente utilizzate per studiare gli effetti delle citochine sull'integrità della barriera.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainer</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3945.070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pituitary extract</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>7.657 185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>3532-010-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline&#160; (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVE-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell counting slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>FD4</td>
			<td>average mol wt 3000-5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus - Megafuge&#160; 40R&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant epidermal growth factor</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein</td>
			<td>R&amp;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>251-KG-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 100-1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 20-200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td></td>
			<td>1134950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T9128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>SAFC Biosciences (Merck)</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris (Bio-Techne)</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional cell culture models to investigate the epithelial barrier in eosinophilic esophagitis 

L'epitelio squamoso dell'esofago è esposto direttamente all'ambiente, affrontando continuamente antigeni estranei, inclusi antigeni alimentari e microbi. Mantenere l'integrità della barriera epiteliale è fondamentale per prevenire le infezioni ed evitare l'infiammazione causata da antigeni innocui di origine alimentare. Questo articolo fornisce protocolli semplificati per la generazione di organoidi esofagei umani e colture di interfaccia aria-liquido da biopsie di pazienti per studiare il compartimento epiteliale dell'esofago nel contesto dell'omeostasi e della malattia tissutale. Questi protocolli sono stati pietre miliari scientifiche significative nell'ultimo decennio, descrivendo strutture tridimensionali simili a organi da cellule primarie derivate da pazienti, organoidi e colture di interfaccia aria-liquido. Offrono la possibilità di studiare la funzione di specifiche citochine, fattori di crescita e vie di segnalazione nell'epitelio esofageo all'interno di un quadro tridimensionale, mantenendo le proprietà fenotipiche e genetiche del donatore. Gli organoidi forniscono informazioni sulla microarchitettura tissutale valutando il trascrittoma e il proteoma dopo la stimolazione delle citochine. Al contrario, le colture di interfaccia aria-liquido consentono di valutare l'integrità della barriera epiteliale attraverso misure di resistenza transepiteliale (TEER) o di flusso di macromolecole. La combinazione di questi organoidi e colture di interfaccia aria-liquido è uno strumento potente per far progredire la ricerca in condizioni di barriera epiteliale esofagea compromessa.

Esophageal inflammation compromises the epithelial barrier integrity1,2,3,4,5, as observed in eosinophilic esophagitis (EoE), a Th2-dominated chronic inflammatory disease of the esophagus6. EoE was first described in the 1990s7,8 and is predominantly induced by food antigens9,10,11,12,13. The most frequently occurring symptoms of EoE in the adult population are dysphagia and food impaction14. In children, EoE typically manifests with failure to thrive, food refusal, vomiting, and abdominal pain15. Genome-wide association studies (GWAS) have identified EoE risk genes involved in epithelial barrier integrity, moving the epithelium into the focus of EoE research16,17,18. EoE transcriptomics further revealed that an impaired differentiation process and a reactive basal zone hyperplasia cause the compromised barrier function of the esophageal epithelium3,5,19,20,21,22. The early understanding of EoE being a Th2-mediated disease6 led to the discovery of IL-13 as a driving mediator by disturbing epithelial integrity3,4,21,23. Experimental systems allowing the dissection of cytokine-mediated effects on epithelial integrity from intrinsic barrier impairment through genetic predisposition provide the possibility to study the complex interplay between immune cells and the epithelium in EoE. Human esophageal organoids and air-liquid interface (ALI) cultures have been proposed as valuable tools to analyze the consequence of cytokine stimulation on epithelial integrity5.
The first protocol for generating adult tissue-specific stem cell (ASC)-derived esophageal organoids was established five years after the first published reports of intestinal organoids in 2009 using intestinal Lgr5+ ASCs recapitulating the epithelial compartment of the small intestine24. DeWard et al. pioneered generating organoids from murine esophageal epithelial cells25. In 2018, Kasagi et al. generated human esophageal organoids from the immortalized human esophageal squamous epithelium cell line EPC2-hTERT and primary patient-derived cells26. In the same year, Zhang et al. successfully generated induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived esophageal organoids. They delineated the significance of TGF&#946; and bone morphogenetic protein (BMP) inhibition for esophageal progenitor cell (EPC) development and the crucial role of Notch signaling in the differentiation of the stratified squamous epithelium26,27. Trisno and colleagues complemented these findings by identifying Sox2 as a Wnt inhibitor that directs the developmental fate towards esophageal differentiation28. The subsequent refinements of protocols, medium composition, and culture conditions increased the organoid formation rate and made subculturing and recovering organoids after cryopreservation possible26,29,30,31,32. Although these organoids are powerful tools for studying tissue architecture and expression of potential target genes after stimulation with cytokines, esophageal organoids will not offer the possibility to measure transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux as direct measures for barrier integrity. As previously described by Sherrill and colleagues22, ALI cultures modeling epithelial differentiation4&#160;allow direct assessments of epithelial integrity. Combining patient-derived organoids and ALI cultures is a powerful tool for investigating tissue architecture and epithelial barrier integrity in EoE.
Here are procedures with instructions for isolating viable cells from esophageal biopsies and establishing esophageal organoid and ALI cultures that can further be used to study the effects of cytokines on barrier integrity.

Autore in primo piano: Indagine sulla fisiopatologia dell'esofagite eosinofila

Modelli tridimensionali di coltura cellulare per studiare la barriera epiteliale nell'esofagite eosinofila 

We are investigating the pathophysiology of eosinophilic esophagitis and trying to unravel the inflammatory cascade inducing and promoting the chronic inflammatory process of EOE. The identification of new immune mediators that contribute to the disease pathogenesis centered around the impairment of epithelial barrier and the approval of therapeutic antibodies against said immune mediators. We have identified the IL-20 subfamily cytokines as inflammatory mediators that impair epithelial differentiation and keratinization resulting in epithelial barrier impairment via the MAP kinase pathway.

Gli organoidi esofagei cresceranno da cellule primarie estratte da biopsie di pazienti secondo le istruzioni del protocollo fornito, come documentato con un microscopio a campo chiaro invertito (Figura 1). Le ASC epiteliali iniziano a formare cluster cellulari in modo auto-organizzante entro i primi due giorni di coltura dopo aver seminato le cellule isolate nell'estratto della membrana basale, fungendo da impalcatura. La dimensione e il numero di cluster cellulari, evidenti con un microscop...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis at JoVE.com

Qui viene fornito un protocollo per la coltura di organoidi esofagei umani e la coltura dell'interfaccia aria-liquido. La coltura dell'interfaccia aria-liquido degli organoidi esofagei può essere utilizzata per studiare l'impatto delle citochine sulla barriera epiteliale esofagea.

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

Stiamo studiando la fisiopatologia dell'esofagite eosinofila e stiamo cercando di svelare la cascata infiammatoria che induce e promuove il processo infiammatorio cronico dell'EOE. L'identificazione di nuovi mediatori immunitari che contribuiscono alla patogenesi della malattia è incentrata sulla compromissione della barriera epiteliale e sull'approvazione di anticorpi terapeutici contro detti mediatori immunitari. Abbiamo identificato le citochine della sottofamiglia IL-20 come mediatori infiammatori che compromettono la differenziazione epiteliale e la cheratinizzazione con conseguente compromissione della barriera epiteliale attraverso la via della MAP chinasi.

Modelli tridimensionali di coltura cellulare per studiare la barriera epiteliale nell'esofagite eosinofila

Abstract