A concessão SNSF 310030_219210 para J.H.N. apoiou a publicação deste manuscrito sem restrições. A Figura 1 foi criada com a ajuda de BioRender.com.

Os procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética do Noroeste e Central da Suíça (EKNZ; ID do projeto 2019-00273). Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para o uso experimental de biópsias antes do exame endoscópico. Os reagentes e equipamentos utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Isolamento celular para organoides esofágicos derivados de pacientes
NOTA: Uma lis...

Organoides esofágicos humanos e protocolos de cultura de interface ar-líquido

Os procedimentos fornecidos permitem o cultivo de organoides derivados de pacientes e culturas de LPA com altas perspectivas de sucesso. O protocolo organoide foi adaptado do primeiro protocolo publicado relatando a geração de organoides esofágicos humanos26 e de um protocolo publicado recentemente32. Sherill e colegas descreveram o modelo ALI22. Organoides e modelos de cultura de LPA auxiliam-se mutuamente no estudo do impacto de citocinas e outr...

A inflamação esofágica compromete a integridade da barreira epitelial 1,2,3,4,5, como observado na esofagite eosinofílica (EoE), uma doença inflamatória crônica do esôfago dominada por Th26. A EoE foi descrita pela primeira vez na década de 1990 7,8 e é predominantemente induzida por antígenos alimentares 9,10,11,12,13. Os sintomas mais frequentes de EoE na população adulta são disfagia e impactação alimentar14. Em crianças, a EoE geralmente se manifesta com retardo do crescimento, recusa alimentar, vômitos e dor abdominal15. Estudos de associação genômica ampla (GWAS) identificaram genes de risco de EoE envolvidos na integridade da barreira epitelial, movendo o epitélio para o foco da pesquisa de EoE 16,17,18. A transcriptômica da EoE revelou ainda que um processo de diferenciação prejudicado e uma hiperplasia reativa da zona basal causam o comprometimento da função de barreira do epitélio esofágico 3,5,19,20,21,22. A compreensão precoce da EoE como uma doença mediada por Th26 levou à descoberta da IL-13 como um mediador determinante, perturbando a integridade epitelial3 , 4 , 21 , 23 . Sistemas experimentais que permitem a dissecação dos efeitos mediados por citocinas na integridade epitelial do comprometimento da barreira intrínseca por meio da predisposição genética fornecem a possibilidade de estudar a complexa interação entre as células imunes e o epitélio na EoE. Organoides esofágicos humanos e culturas de interface ar-líquido (LPA) têm sido propostos como ferramentas valiosas para analisar a consequência da estimulação de citocinas na integridade epitelial5.
O primeiro protocolo para geração de organoides esofágicos derivados de células-tronco específicas de tecido adulto (ASC) foi estabelecido cinco anos após os primeiros relatos publicados de organoides intestinais em 2009, usando ASCs Lgr5+ intestinais recapitulando o compartimento epitelial do intestino delgado24. DeWard et al. foram pioneiros na geração de organoides a partir de células epiteliais esofágicas murinas25. Em 2018, Kasagi et al. geraram organoides esofágicos humanos a partir da linha celular de epitélio escamoso esofágico humano imortalizada EPC2-hTERT e células primárias derivadas de pacientes26. No mesmo ano, Zhang et al. geraram com sucesso organoides esofágicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC). Eles delinearam a importância da inibição do TGFβ e da proteína morfogenética óssea (BMP) para o desenvolvimento de células progenitoras esofágicas (EPC) e o papel crucial da sinalização Notch na diferenciação do epitélio escamoso estratificado26,27. Trisno e colegas complementaram essas descobertas identificando o Sox2 como um inibidor de Wnt que direciona o destino do desenvolvimento para a diferenciação esofágica28. Os refinamentos subsequentes de protocolos, composição do meio e condições de cultura aumentaram a taxa de formação de organoides e possibilitaram a subcultura e recuperação de organoides após a criopreservação 26,29,30,31,32. Embora esses organoides sejam ferramentas poderosas para estudar a arquitetura do tecido e a expressão de genes-alvo potenciais após estimulação com citocinas, os organoides esofágicos não oferecerão a possibilidade de medir a resistência transepitelial (TEER) ou o fluxo de macromoléculas como medidas diretas para a integridade da barreira. Conforme descrito anteriormente por Sherrill e colegas22, as culturas ALI que modelam a diferenciação epitelial4 permitem avaliações diretas da integridade epitelial. A combinação de organoides derivados de pacientes e culturas de LPA é uma ferramenta poderosa para investigar a arquitetura do tecido e a integridade da barreira epitelial na EoE.
Aqui estão os procedimentos com instruções para isolar células viáveis de biópsias esofágicas e estabelecer culturas de organoides esofágicos e ALI que podem ser usados para estudar os efeitos das citocinas na integridade da barreira.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainer</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3945.070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pituitary extract</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>7.657 185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>3532-010-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline&#160; (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVE-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell counting slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>FD4</td>
			<td>average mol wt 3000-5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus - Megafuge&#160; 40R&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant epidermal growth factor</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein</td>
			<td>R&amp;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>251-KG-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 100-1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 20-200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td></td>
			<td>1134950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T9128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>SAFC Biosciences (Merck)</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris (Bio-Techne)</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional cell culture models to investigate the epithelial barrier in eosinophilic esophagitis 

O epitélio escamoso do esôfago é diretamente exposto ao ambiente, enfrentando continuamente antígenos estranhos, incluindo antígenos alimentares e micróbios. Manter a integridade da barreira epitelial é fundamental para prevenir infecções e evitar a inflamação causada por antígenos inofensivos derivados de alimentos. Este artigo fornece protocolos simplificados para gerar organoides esofágicos humanos e culturas de interface ar-líquido a partir de biópsias de pacientes para estudar o compartimento epitelial do esôfago no contexto da homeostase tecidual e da doença. Esses protocolos foram marcos científicos significativos na última década, descrevendo estruturas tridimensionais semelhantes a órgãos de células primárias derivadas de pacientes, organoides e culturas de interface ar-líquido. Eles oferecem a possibilidade de investigar a função de citocinas específicas, fatores de crescimento e vias de sinalização no epitélio esofágico dentro de uma estrutura tridimensional, mantendo as propriedades fenotípicas e genéticas do doador. Os organoides fornecem informações sobre a microarquitetura tecidual, avaliando o transcriptoma e o proteoma após a estimulação de citocinas. Em contraste, as culturas de interface ar-líquido permitem a avaliação da integridade da barreira epitelial por meio de medições de resistência transepitelial (TEER) ou fluxo de macromoléculas. A combinação desses organoides e culturas de interface ar-líquido é uma ferramenta poderosa para avançar na pesquisa em condições de barreira epitelial esofágica prejudicadas.

Esophageal inflammation compromises the epithelial barrier integrity1,2,3,4,5, as observed in eosinophilic esophagitis (EoE), a Th2-dominated chronic inflammatory disease of the esophagus6. EoE was first described in the 1990s7,8 and is predominantly induced by food antigens9,10,11,12,13. The most frequently occurring symptoms of EoE in the adult population are dysphagia and food impaction14. In children, EoE typically manifests with failure to thrive, food refusal, vomiting, and abdominal pain15. Genome-wide association studies (GWAS) have identified EoE risk genes involved in epithelial barrier integrity, moving the epithelium into the focus of EoE research16,17,18. EoE transcriptomics further revealed that an impaired differentiation process and a reactive basal zone hyperplasia cause the compromised barrier function of the esophageal epithelium3,5,19,20,21,22. The early understanding of EoE being a Th2-mediated disease6 led to the discovery of IL-13 as a driving mediator by disturbing epithelial integrity3,4,21,23. Experimental systems allowing the dissection of cytokine-mediated effects on epithelial integrity from intrinsic barrier impairment through genetic predisposition provide the possibility to study the complex interplay between immune cells and the epithelium in EoE. Human esophageal organoids and air-liquid interface (ALI) cultures have been proposed as valuable tools to analyze the consequence of cytokine stimulation on epithelial integrity5.
The first protocol for generating adult tissue-specific stem cell (ASC)-derived esophageal organoids was established five years after the first published reports of intestinal organoids in 2009 using intestinal Lgr5+ ASCs recapitulating the epithelial compartment of the small intestine24. DeWard et al. pioneered generating organoids from murine esophageal epithelial cells25. In 2018, Kasagi et al. generated human esophageal organoids from the immortalized human esophageal squamous epithelium cell line EPC2-hTERT and primary patient-derived cells26. In the same year, Zhang et al. successfully generated induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived esophageal organoids. They delineated the significance of TGF&#946; and bone morphogenetic protein (BMP) inhibition for esophageal progenitor cell (EPC) development and the crucial role of Notch signaling in the differentiation of the stratified squamous epithelium26,27. Trisno and colleagues complemented these findings by identifying Sox2 as a Wnt inhibitor that directs the developmental fate towards esophageal differentiation28. The subsequent refinements of protocols, medium composition, and culture conditions increased the organoid formation rate and made subculturing and recovering organoids after cryopreservation possible26,29,30,31,32. Although these organoids are powerful tools for studying tissue architecture and expression of potential target genes after stimulation with cytokines, esophageal organoids will not offer the possibility to measure transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux as direct measures for barrier integrity. As previously described by Sherrill and colleagues22, ALI cultures modeling epithelial differentiation4&#160;allow direct assessments of epithelial integrity. Combining patient-derived organoids and ALI cultures is a powerful tool for investigating tissue architecture and epithelial barrier integrity in EoE.
Here are procedures with instructions for isolating viable cells from esophageal biopsies and establishing esophageal organoid and ALI cultures that can further be used to study the effects of cytokines on barrier integrity.

Autor em destaque: Investigando a fisiopatologia da esofagite eosinofílica

Modelos tridimensionais de cultura celular para investigar a barreira epitelial na esofagite eosinofílica 

We are investigating the pathophysiology of eosinophilic esophagitis and trying to unravel the inflammatory cascade inducing and promoting the chronic inflammatory process of EOE. The identification of new immune mediators that contribute to the disease pathogenesis centered around the impairment of epithelial barrier and the approval of therapeutic antibodies against said immune mediators. We have identified the IL-20 subfamily cytokines as inflammatory mediators that impair epithelial differentiation and keratinization resulting in epithelial barrier impairment via the MAP kinase pathway.

Os organoides esofágicos crescerão a partir de células primárias extraídas de biópsias de pacientes de acordo com as instruções do protocolo fornecido, conforme documentado com um microscópio de campo claro invertido (Figura 1). As ASCs epiteliais começam a formar aglomerados de células de maneira auto-organizada nos primeiros dois dias de cultura após a semeadura das células isoladas no extrato da membrana basal, servindo como um andaime. O tamanho e o número de aglomerados de...

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Aqui, é fornecido um protocolo para a cultura de organoides esofágicos humanos e cultura de interface ar-líquido. A cultura de interface ar-líquido dos organoides esofágicos pode ser usada para estudar o impacto das citocinas na barreira epitelial esofágica.

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

Estamos investigando a fisiopatologia da esofagite eosinofílica e tentando desvendar a cascata inflamatória que induz e promove o processo inflamatório crônico da EOE. A identificação de novos mediadores imunológicos que contribuem para a patogênese da doença centrou-se no comprometimento da barreira epitelial e na aprovação de anticorpos terapêuticos contra esses mediadores imunológicos. Identificamos as citocinas da subfamília IL-20 como mediadores inflamatórios que prejudicam a diferenciação epitelial e a queratinização, resultando em comprometimento da barreira epitelial pela via MAP quinase.

Modelos tridimensionais de cultura celular para investigar a barreira epitelial na esofagite eosinofílica

Abstract