SNSF-anslaget 310030_219210 till J.H.N. stödde publiceringen av detta manuskript utan begränsningar. Figur 1 har skapats med hjälp av BioRender.com.

Förfarandena godkändes av den etiska kommittén i nordvästra och centrala Schweiz (EKNZ; Projekt-ID 2019-00273). Alla patienter gav skriftligt informerat samtycke till experimentell användning av biopsier före den endoskopiska undersökningen. De reagenser och utrustning som användes i studien är listade i materialtabellen.
1. Cellisolering för patienthärledda esofagusorganoider
OBS: En lista över mediets beståndsdelar för...

Humana esofagusorganoider och protokoll för luft-vätskegränssnittsodling

De tillhandahållna procedurerna gör det möjligt att odla patienthärledda organoider och ALI-kulturer med stora utsikter till framgång. Organoidprotokollet har anpassats från det första publicerade protokollet som rapporterar genereringen av humana esofagusorganoider26 och från ett nyligen publicerat protokoll32. Sherill och kollegor har beskrivit ALI-modellen22. Organoider och ALI-odlingsmodeller hjälper varandra att studera effekten av cyto...

Esofagusinflammation äventyrar epitelbarriärens integritet 1,2,3,4,5, som observerats vid eosinofil esofagit (EoE), en Th2-dominerad kronisk inflammatorisk sjukdom i matstrupen 6. EoE beskrevs första gången på 1990-talet 7,8 och induceras främst av livsmedelsantigener 9,10,11,12,13. De vanligast förekommande symtomen på EoE i den vuxna befolkningen är dysfagi och födoämnespåverkan14. Hos barn manifesterar sig EoE vanligtvis i form av bristande tillväxt, matvägran, kräkningar och buksmärtor15. Genome-wide association studies (GWAS) har identifierat EoE-riskgener som är involverade i epitelbarriärens integritet, vilket har flyttat epitelet till fokus för EoE-forskning 16,17,18. EoE-transkriptomik avslöjade vidare att en försämrad differentieringsprocess och en reaktiv basalzonshyperplasi orsakar den komprometterade barriärfunktionen hos matstrupepitelet 3,5,19,20,21,22. Den tidiga förståelsen av att EoE är en Th2-medierad sjukdom6 ledde till upptäckten av IL-13 som en drivande mediator genom att störa epitelintegriteten 3,4,21,23. Experimentella system som möjliggör dissektion av cytokinmedierade effekter på epitelial integritet från inneboende barriärnedsättning genom genetisk predisposition ger möjlighet att studera det komplexa samspelet mellan immunceller och epitelet i EoE. Humana esofagusorganoider och luft-vätskegränssnittskulturer (ALI) har föreslagits som värdefulla verktyg för att analysera konsekvensen av cytokinstimulering på epitelial integritet5.
Det första protokollet för att generera vuxna vävnadsspecifika stamceller (ASC)-härledda esofagusorganoider etablerades fem år efter de första publicerade rapporterna om tarmorganoider 2009 med hjälp av intestinala Lgr5+ ASC:er som rekapitulerar epitelfacket i tunntarmen24. DeWard et al. var pionjärer när det gällde att generera organoider från murina esofageala epitelceller25. År 2018 genererade Kasagi et al. humana esofagusorganoider från den odödliga humana esofagus skivepitelcellinjen EPC2-hTERT och primära patienthärledda celler26. Samma år genererade Zhang et al. framgångsrikt inducerade pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda esofagusorganoider. De avgränsade betydelsen av TGFβ och benmorfogenetiskt protein (BMP) hämning för utveckling av esofagus stamceller (EPC) och den avgörande rollen för Notch-signalering i differentieringen av det stratifierade skivepitelet26,27. Trisno och kollegor kompletterade dessa fynd genom att identifiera Sox2 som en Wnt-hämmare som styr utvecklingsödet mot esofagusdifferentiering28. De efterföljande förbättringarna av protokoll, mediesammansättning och odlingsförhållanden ökade organoidbildningshastigheten och gjorde det möjligt att subkultivera och återvinna organoider efter kryokonservering 26,29,30,31,32. Även om dessa organoider är kraftfulla verktyg för att studera vävnadsarkitektur och uttryck av potentiella målgener efter stimulering med cytokiner, kommer esofagusorganoider inte att erbjuda möjligheten att mäta transepitelial resistens (TEER) eller makromolekylflöde som direkta mått på barriärintegritet. Som tidigare beskrivits av Sherrill och kollegor22 tillåter ALI-kulturer som modellerar epiteldifferentiering4 direkta bedömningar av epitelial integritet. Att kombinera patienthärledda organoider och ALI-kulturer är ett kraftfullt verktyg för att undersöka vävnadsarkitektur och epitelbarriärintegritet i EoE.
Här är procedurer med instruktioner för att isolera livskraftiga celler från esofagusbiopsier och etablera esofagusorganoid- och ALI-kulturer som vidare kan användas för att studera effekterna av cytokiner på barriärintegriteten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainer</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3945.070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pituitary extract</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>7.657 185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>3532-010-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline&#160; (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVE-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell counting slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>FD4</td>
			<td>average mol wt 3000-5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus - Megafuge&#160; 40R&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant epidermal growth factor</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein</td>
			<td>R&amp;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>251-KG-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 100-1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 20-200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td></td>
			<td>1134950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T9128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>SAFC Biosciences (Merck)</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris (Bio-Techne)</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional cell culture models to investigate the epithelial barrier in eosinophilic esophagitis 

Skivepitelet i matstrupen utsätts direkt för miljön och utsätts kontinuerligt för främmande antigener, inklusive livsmedelsantigener och mikrober. Att upprätthålla integriteten hos epitelbarriären är avgörande för att förhindra infektioner och undvika inflammation orsakad av ofarliga livsmedelshärledda antigener. Denna artikel tillhandahåller förenklade protokoll för att generera humana esofagusorganoider och luft-vätskegränssnittskulturer från patientbiopsier för att studera epitelfacket i matstrupen i samband med vävnadshomeostas och sjukdom. Dessa protokoll har varit viktiga vetenskapliga milstolpar under det senaste decenniet och beskriver tredimensionella organliknande strukturer från primära celler, organoider och gränsskiktskulturer mellan luft och vätska. De erbjuder möjligheten att undersöka funktionen av specifika cytokiner, tillväxtfaktorer och signalvägar i matstrupepitelet inom ett tredimensionellt ramverk samtidigt som donatorns fenotypiska och genetiska egenskaper bibehålls. Organoider ger information om vävnadens mikroarkitektur genom att bedöma transkriptomet och proteomet efter cytokinstimulering. Däremot tillåter gränsskiktskulturer mellan luft och vätska bedömning av epitelbarriärens integritet genom mätningar av transepitelial resistens (TEER) eller makromolekylflöde. Att kombinera dessa organoider och luft-vätskegränssnittskulturer är ett kraftfullt verktyg för att främja forskning om försämrade esofagusepitelbarriärförhållanden.

Esophageal inflammation compromises the epithelial barrier integrity1,2,3,4,5, as observed in eosinophilic esophagitis (EoE), a Th2-dominated chronic inflammatory disease of the esophagus6. EoE was first described in the 1990s7,8 and is predominantly induced by food antigens9,10,11,12,13. The most frequently occurring symptoms of EoE in the adult population are dysphagia and food impaction14. In children, EoE typically manifests with failure to thrive, food refusal, vomiting, and abdominal pain15. Genome-wide association studies (GWAS) have identified EoE risk genes involved in epithelial barrier integrity, moving the epithelium into the focus of EoE research16,17,18. EoE transcriptomics further revealed that an impaired differentiation process and a reactive basal zone hyperplasia cause the compromised barrier function of the esophageal epithelium3,5,19,20,21,22. The early understanding of EoE being a Th2-mediated disease6 led to the discovery of IL-13 as a driving mediator by disturbing epithelial integrity3,4,21,23. Experimental systems allowing the dissection of cytokine-mediated effects on epithelial integrity from intrinsic barrier impairment through genetic predisposition provide the possibility to study the complex interplay between immune cells and the epithelium in EoE. Human esophageal organoids and air-liquid interface (ALI) cultures have been proposed as valuable tools to analyze the consequence of cytokine stimulation on epithelial integrity5.
The first protocol for generating adult tissue-specific stem cell (ASC)-derived esophageal organoids was established five years after the first published reports of intestinal organoids in 2009 using intestinal Lgr5+ ASCs recapitulating the epithelial compartment of the small intestine24. DeWard et al. pioneered generating organoids from murine esophageal epithelial cells25. In 2018, Kasagi et al. generated human esophageal organoids from the immortalized human esophageal squamous epithelium cell line EPC2-hTERT and primary patient-derived cells26. In the same year, Zhang et al. successfully generated induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived esophageal organoids. They delineated the significance of TGF&#946; and bone morphogenetic protein (BMP) inhibition for esophageal progenitor cell (EPC) development and the crucial role of Notch signaling in the differentiation of the stratified squamous epithelium26,27. Trisno and colleagues complemented these findings by identifying Sox2 as a Wnt inhibitor that directs the developmental fate towards esophageal differentiation28. The subsequent refinements of protocols, medium composition, and culture conditions increased the organoid formation rate and made subculturing and recovering organoids after cryopreservation possible26,29,30,31,32. Although these organoids are powerful tools for studying tissue architecture and expression of potential target genes after stimulation with cytokines, esophageal organoids will not offer the possibility to measure transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux as direct measures for barrier integrity. As previously described by Sherrill and colleagues22, ALI cultures modeling epithelial differentiation4&#160;allow direct assessments of epithelial integrity. Combining patient-derived organoids and ALI cultures is a powerful tool for investigating tissue architecture and epithelial barrier integrity in EoE.
Here are procedures with instructions for isolating viable cells from esophageal biopsies and establishing esophageal organoid and ALI cultures that can further be used to study the effects of cytokines on barrier integrity.

Författare i fokus: Undersöker patofysiologin vid eosinofil esofagit

Tredimensionella cellodlingsmodeller för att undersöka epitelbarriären vid eosinofil esofagit 

We are investigating the pathophysiology of eosinophilic esophagitis and trying to unravel the inflammatory cascade inducing and promoting the chronic inflammatory process of EOE. The identification of new immune mediators that contribute to the disease pathogenesis centered around the impairment of epithelial barrier and the approval of therapeutic antibodies against said immune mediators. We have identified the IL-20 subfamily cytokines as inflammatory mediators that impair epithelial differentiation and keratinization resulting in epithelial barrier impairment via the MAP kinase pathway.

Esofagusorganoider kommer att växa från primära celler som extraherats från patientbiopsier enligt instruktionerna i det medföljande protokollet, som dokumenterats med ett inverterat ljusfältsmikroskop (figur 1). Epiteliala ASC:er börjar bilda cellkluster på ett självorganiserande sätt inom de två första dagarna av odlingen efter att ha sått de isolerade cellerna i basalmembranextraktet, som fungerar som en byggnadsställning. Storleken och antalet cellkluster, som kan märkas m...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis at JoVE.com

Här tillhandahålls ett protokoll för odling av humana esofagusorganoider och luft-vätskegränssnittskultur. Esofagusorganoiders luft-vätskegränssnittskultur kan användas för att studera effekten av cytokiner på den esofagusepiteliala barriären.

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

Vi undersöker patofysiologin vid eosinofil esofagit och försöker reda ut den inflammatoriska kaskad som inducerar och främjar den kroniska inflammatoriska processen vid EOE. Identifieringen av nya immunmediatorer som bidrar till sjukdomspatogenesen är centrerad kring försämringen av epitelbarriären och godkännandet av terapeutiska antikroppar mot nämnda immunmediatorer. Vi har identifierat IL-20-underfamiljen cytokiner som inflammatoriska mediatorer som försämrar epiteldifferentiering och keratinisering vilket resulterar i epitelbarriärförsämring via MAP-kinasvägen.

Tredimensionella cellodlingsmodeller för att undersöka epitelbarriären vid eosinofil esofagit

Abstract