אפיון אפנן קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז עם בדיקת ניוד סידן באמצעות קורא צלחות

Summary

פותח פרוטוקול משופר לבדיקת ניוד סידן עם תאי אנדותל, המשמש לזיהוי ליגנדות של קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז (PARs). הפרוטוקול החדש מקצר את זמן הבדיקה הכולל ב-90-120 דקות ומניב עקומות ריכוז-תגובה הניתנות לשחזור.

Abstract

שינויים בריכוז הסידן בתאים מנוטרים במהירות בתפוקה גבוהה באמצעות שימוש בצבעים תוך-תאיים, פלואורסצנטיים, קושרי סידן ומכשירי הדמיה שיכולים למדוד פליטות פלואורסצנטיות מעד 1,536 בארות בו זמנית. עם זאת, מכשירים אלה יקרים בהרבה ויכולים להיות מאתגרים לתחזוקה ביחס לקוראי לוחות זמינים באופן נרחב שסורקים בארות בנפרד. מתואר כאן מבחן קורא לוחות ממוטב לשימוש עם קו תאי אנדותל (EA.hy926) למדידת הפעלה מונעת קולטן המופעל על ידי פרוטאז (PAR) של איתות G_αq וניוד סידן לאחר מכן באמצעות הצבע קושר הסידן Fluo-4. בדיקה זו שימשה לאפיון מגוון ליגנדות PAR, כולל ליגנדות "פרמודולין" אנטי-דלקתיות אלוסטריות המכוונות ל-PAR1 שזוהו במעבדת דוקנדורף. פרוטוקול זה מייתר את הצורך בטיפול אוטומטי בנוזלים ומאפשר סינון בתפוקה בינונית של ליגנדות PAR בלוחות 96 בארות ואמור להיות ישים לחקר קולטנים אחרים היוזמים ניוד סידן.

Introduction

קולטנים המופעלים על ידי פרוטאז (PARs)^1,2,3 הם תת-משפחה של קולטנים מצומדים לחלבון G מסוג A (GPCRs) המתבטאים במגוון סוגי תאים, כולל טסיות דם ותאי אנדותל ^4,5,6,7. שלא כמו רוב GPCRs, PARs יש מצב ייחודי intramolecular של הפעלה. רוב GPCRs מופעלים על ידי ליגנדות מסיסות, אינטראקציה עם כיס קישור נפרד, אבל PARs מופעלים על ידי מחשוף פרוטאוליטי של N-terminus, אשר גורם ליגנד קשור חדש שיכול לתקשר עם תחום לולאה חוץ-תאית 2....

Protocol

כל חילופי המדיה/התוספות המבוצעים בשלבים 1 ו-2 של הפרוטוקול הבא מבוצעים במכסה מנוע סטרילי. אלא אם כן צוין אחרת, כל כלי הפלסטיק המשמשים במכסה המנוע הסטרילי חייבים להיות נרכשים, מעוקרים ואטומים או מעוקרים כראוי באמצעות autoclave.

1. הפעלת קו תאים EA.hy926

Discussion

בעוד פרוטוקול⁷² שדווח בעבר היה אמין בדרך כלל ואפשר לנו לזהות פרמודולין עופרת חדש, NRD-21,62 היה רצוי פרוטוקול יעיל יותר. הבדיקה נפגעה עוד יותר במהלך המחסור באספקה שנגרם על ידי מגפת הקורונה. השגת טיפים עבור המטפל האוטומטי בנוזלים הפכה לקשה, והניסיון ל.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cells	ATCC	CRL-2922
CellStripper cell dissociation reagent	Corning	25-056-CI	Trypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol red	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	97068-091
Gelatin from porcine skin	MilliporeSigma	G2500	Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)	Corning	30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)	Corning	25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Thermo	172571000
Bovine serum albumin (BSA)	Avantor	97061-420
Calcium chloride dihydrate	Thermo	42352-0250
Dimethyl sulfoxide	Thermo	J66650-AD
Fluo-4/AM	Invitrogen	F14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)	Corning	21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrate	MilliporeSigma	M2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)	Spectrum Chemical	P1166
Probenecid	TCI America	P1975
Sodium hydroxide	VWR International	BDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)			Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plate	Corning	3603	with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mL	Avantor	89039-664
Centrifuge tube, 50 mL	Avantor	89039-656
Culture flask, T-75	Corning	353136	tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mL	Corning	RES-V-50-S
Enspire plate reader	Perkin Elmer		Discontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mL	Avantor	20170-038
Pasteur pipette, 9"	Fisher	13-678-6B	must be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap strips	Avantor	76318-802
Pipette tips, 20 µL	Biotix	63300042	sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µL	Biotix	63300044	sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µL	Biotix	63300047	sterile, filtered tips
Prism	GraphPad		volume 6 used
Serological pipette, 5 mL	Tradewinds Direct	07-5005
Serological pipette, 10 mL	Tradewinds Direct	07-5010
Serological pipette, 25 mL	Tradewinds Direct	07-5025