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Um protocolo aprimorado para um ensaio de mobilização de cálcio com células endoteliais, usado para identificar ligantes de receptores ativados por protease (PARs), foi desenvolvido. O novo protocolo reduz o tempo total de ensaio em 90-120 min e produz curvas de concentração-resposta reprodutíveis.
As mudanças na concentração de cálcio nas células são rapidamente monitoradas de forma de alto rendimento com o uso de corantes intracelulares, fluorescentes e de ligação ao cálcio e instrumentos de imagem que podem medir as emissões fluorescentes de até 1.536 poços simultaneamente. No entanto, esses instrumentos são muito mais caros e podem ser difíceis de manter em relação aos leitores de placas amplamente disponíveis que escaneiam os poços individualmente. Aqui é descrito um ensaio otimizado de leitor de placas para uso com uma linhagem de células endoteliais (EA.hy926) para medir a ativação acionada pelo receptor ativado por protease (PAR) da sinalização Gαq e subsequente mobilização de cálcio usando o corante de ligação ao cálcio Fluo-4. Este ensaio foi usado para caracterizar uma variedade de ligantes PAR, incluindo os ligantes anti-inflamatórios alostéricos de "parmodulina" direcionados a PAR1 identificados no laboratório de Dockendorff. Este protocolo evita a necessidade de um manipulador de líquido automatizado e permite a triagem de médio rendimento de ligantes PAR em placas de 96 poços e deve ser aplicável ao estudo de outros receptores que iniciam a mobilização de cálcio.
Os receptores ativados por protease (PARs)1,2,3 são uma subfamília de receptores acoplados à proteína G classe A (GPCRs) que são expressos em uma variedade de tipos de células, incluindo plaquetas e células endoteliais 4,5,6,7. Ao contrário da maioria dos GPCRs, os PARs têm um modo intramolecular único de ativação. A maioria dos GPCRs é ativada por ligantes solúveis interagindo com uma bolsa de ligação distinta, mas....
Todas as trocas/adições de mídia feitas nas etapas 1 e 2 do protocolo a seguir são realizadas em uma coifa estéril. Salvo indicação em contrário, todos os utensílios de plástico usados no capô estéril devem ser adquiridos esterilizados e selados ou esterilizados adequadamente por autoclave.
1. Iniciação da linhagem celular EA.hy926
O objetivo deste ensaio é geralmente produzir curvas de concentração-resposta (CRCs) para três a quatro novas parmodulinas. Em cada placa de ensaio, é frequentemente gerado um CRC adicional para um composto conhecido, como NRD-21, que atua como uma verificação de qualidade para o experimento devido ao seu IC50 conhecido. Para gerar CRCs, um mapa de placas como o representado na Tabela 1 deve ser planejado. Se, em vez disso, forem desejadas respostas de .......
Enquanto o protocolo72 relatado anteriormente era geralmente confiável e nos permitia identificar uma nova parmodulina de chumbo, NRD-21,62 um protocolo mais eficiente era desejado. O ensaio foi ainda mais comprometido durante a escassez de suprimentos causada pela pandemia de COVID-19. A aquisição de ponteiras para o manipulador automatizado de líquidos tornou-se difícil, e a tentativa de lavar, esterilizar e reutilizar as ponteiras p.......
Agradecemos a Irene Hernandez, Trudy Holyst, Dr. Hartmut Weiler (Versiti Blood Research Institute) e Dr. Leggy Arnold (University of Wisconsin-Milwaukee) por fornecer espaço e apoio indireto a este projeto, e ao Dr. John McCorvy (Medical College of Wisconsin) pelos conselhos pertinentes. Agradecemos ao Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue (R15HL127636), ao Departamento de Defesa dos EUA (W81XWH22101) e à National Science Foundation (2223225) pelo apoio financeiro.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell Culture Reagents | |||
Adherent EA.hy926 cells | ATCC | CRL-2922 | |
CellStripper cell dissociation reagent | Corning | 25-056-CI | Trypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays. |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol red | Corning | 10-013-CV | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-091 | |
Gelatin from porcine skin | MilliporeSigma | G2500 | Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize. |
Pen/Strep (100X) | Corning | 30-002-CI | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
Trypan Blue (0.4% w/v) | Corning | 25-900-CI | |
Calcium Mobilization Reagents | |||
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Thermo | 172571000 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Avantor | 97061-420 | |
Calcium chloride dihydrate | Thermo | 42352-0250 | |
Dimethyl sulfoxide | Thermo | J66650-AD | |
Fluo-4/AM | Invitrogen | F14201 | |
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free) | Corning | 21-022-CV | |
Magnesium chloride hexahydrate | MilliporeSigma | M2393 | |
Pluronic F-127 (Poloxamer 407) | Spectrum Chemical | P1166 | |
Probenecid | TCI America | P1975 | |
Sodium hydroxide | VWR International | BDH9292 | |
TFLLRN-NH2 (TFA salt) | Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute | ||
Materials | |||
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plate | Corning | 3603 | with transparent lids |
Centrifuge tube, 15 mL | Avantor | 89039-664 | |
Centrifuge tube, 50 mL | Avantor | 89039-656 | |
Culture flask, T-75 | Corning | 353136 | tissue culture treated |
Disposable reagent reservoir, 50 mL | Corning | RES-V-50-S | |
Enspire plate reader | Perkin Elmer | Discontinued | |
Microcentrifuge tube, 1.5 mL | Avantor | 20170-038 | |
Pasteur pipette, 9" | Fisher | 13-678-6B | must be sterilized |
PCR tube strip with separate flat cap strips | Avantor | 76318-802 | |
Pipette tips, 20 µL | Biotix | 63300042 | sterile, filtered tips |
Pipette tips, 200 µL | Biotix | 63300044 | sterile, filtered tips |
Pipette tips, 1250 µL | Biotix | 63300047 | sterile, filtered tips |
Prism | GraphPad | volume 6 used | |
Serological pipette, 5 mL | Tradewinds Direct | 07-5005 | |
Serological pipette, 10 mL | Tradewinds Direct | 07-5010 | |
Serological pipette, 25 mL | Tradewinds Direct | 07-5025 |
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