Caracterização de moduladores de receptores ativados por protease com um ensaio de mobilização de cálcio usando um leitor de placas

Summary

Um protocolo aprimorado para um ensaio de mobilização de cálcio com células endoteliais, usado para identificar ligantes de receptores ativados por protease (PARs), foi desenvolvido. O novo protocolo reduz o tempo total de ensaio em 90-120 min e produz curvas de concentração-resposta reprodutíveis.

Abstract

As mudanças na concentração de cálcio nas células são rapidamente monitoradas de forma de alto rendimento com o uso de corantes intracelulares, fluorescentes e de ligação ao cálcio e instrumentos de imagem que podem medir as emissões fluorescentes de até 1.536 poços simultaneamente. No entanto, esses instrumentos são muito mais caros e podem ser difíceis de manter em relação aos leitores de placas amplamente disponíveis que escaneiam os poços individualmente. Aqui é descrito um ensaio otimizado de leitor de placas para uso com uma linhagem de células endoteliais (EA.hy926) para medir a ativação acionada pelo receptor ativado por protease (PAR) da sinalização G_αq e subsequente mobilização de cálcio usando o corante de ligação ao cálcio Fluo-4. Este ensaio foi usado para caracterizar uma variedade de ligantes PAR, incluindo os ligantes anti-inflamatórios alostéricos de "parmodulina" direcionados a PAR1 identificados no laboratório de Dockendorff. Este protocolo evita a necessidade de um manipulador de líquido automatizado e permite a triagem de médio rendimento de ligantes PAR em placas de 96 poços e deve ser aplicável ao estudo de outros receptores que iniciam a mobilização de cálcio.

Introduction

Os receptores ativados por protease (PARs)^1,2,3 são uma subfamília de receptores acoplados à proteína G classe A (GPCRs) que são expressos em uma variedade de tipos de células, incluindo plaquetas e células endoteliais ^4,5,6,7. Ao contrário da maioria dos GPCRs, os PARs têm um modo intramolecular único de ativação. A maioria dos GPCRs é ativada por ligantes solúveis interagindo com uma bolsa de ligação distinta, mas....

Protocol

Todas as trocas/adições de mídia feitas nas etapas 1 e 2 do protocolo a seguir são realizadas em uma coifa estéril. Salvo indicação em contrário, todos os utensílios de plástico usados no capô estéril devem ser adquiridos esterilizados e selados ou esterilizados adequadamente por autoclave.

1. Iniciação da linhagem celular EA.hy926

1. Adquira células EA.hy926.
2. Armazene o(s) frasco(s) para injetáveis de células.......

Discussion

Enquanto o protocolo⁷² relatado anteriormente era geralmente confiável e nos permitia identificar uma nova parmodulina de chumbo, NRD-21,62 um protocolo mais eficiente era desejado. O ensaio foi ainda mais comprometido durante a escassez de suprimentos causada pela pandemia de COVID-19. A aquisição de ponteiras para o manipulador automatizado de líquidos tornou-se difícil, e a tentativa de lavar, esterilizar e reutilizar as ponteiras p.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cells	ATCC	CRL-2922
CellStripper cell dissociation reagent	Corning	25-056-CI	Trypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol red	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	97068-091
Gelatin from porcine skin	MilliporeSigma	G2500	Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)	Corning	30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)	Corning	25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Thermo	172571000
Bovine serum albumin (BSA)	Avantor	97061-420
Calcium chloride dihydrate	Thermo	42352-0250
Dimethyl sulfoxide	Thermo	J66650-AD
Fluo-4/AM	Invitrogen	F14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)	Corning	21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrate	MilliporeSigma	M2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)	Spectrum Chemical	P1166
Probenecid	TCI America	P1975
Sodium hydroxide	VWR International	BDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)			Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plate	Corning	3603	with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mL	Avantor	89039-664
Centrifuge tube, 50 mL	Avantor	89039-656
Culture flask, T-75	Corning	353136	tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mL	Corning	RES-V-50-S
Enspire plate reader	Perkin Elmer		Discontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mL	Avantor	20170-038
Pasteur pipette, 9"	Fisher	13-678-6B	must be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap strips	Avantor	76318-802
Pipette tips, 20 µL	Biotix	63300042	sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µL	Biotix	63300044	sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µL	Biotix	63300047	sterile, filtered tips
Prism	GraphPad		volume 6 used
Serological pipette, 5 mL	Tradewinds Direct	07-5005
Serological pipette, 10 mL	Tradewinds Direct	07-5010
Serological pipette, 25 mL	Tradewinds Direct	07-5025