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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Um protocolo aprimorado para um ensaio de mobilização de cálcio com células endoteliais, usado para identificar ligantes de receptores ativados por protease (PARs), foi desenvolvido. O novo protocolo reduz o tempo total de ensaio em 90-120 min e produz curvas de concentração-resposta reprodutíveis.

Abstract

As mudanças na concentração de cálcio nas células são rapidamente monitoradas de forma de alto rendimento com o uso de corantes intracelulares, fluorescentes e de ligação ao cálcio e instrumentos de imagem que podem medir as emissões fluorescentes de até 1.536 poços simultaneamente. No entanto, esses instrumentos são muito mais caros e podem ser difíceis de manter em relação aos leitores de placas amplamente disponíveis que escaneiam os poços individualmente. Aqui é descrito um ensaio otimizado de leitor de placas para uso com uma linhagem de células endoteliais (EA.hy926) para medir a ativação acionada pelo receptor ativado por protease (PAR) da sinalização Gαq e subsequente mobilização de cálcio usando o corante de ligação ao cálcio Fluo-4. Este ensaio foi usado para caracterizar uma variedade de ligantes PAR, incluindo os ligantes anti-inflamatórios alostéricos de "parmodulina" direcionados a PAR1 identificados no laboratório de Dockendorff. Este protocolo evita a necessidade de um manipulador de líquido automatizado e permite a triagem de médio rendimento de ligantes PAR em placas de 96 poços e deve ser aplicável ao estudo de outros receptores que iniciam a mobilização de cálcio.

Introduction

Os receptores ativados por protease (PARs)1,2,3 são uma subfamília de receptores acoplados à proteína G classe A (GPCRs) que são expressos em uma variedade de tipos de células, incluindo plaquetas e células endoteliais 4,5,6,7. Ao contrário da maioria dos GPCRs, os PARs têm um modo intramolecular único de ativação. A maioria dos GPCRs é ativada por ligantes solúveis interagindo com uma bolsa de ligação distinta, mas....

Protocol

Todas as trocas/adições de mídia feitas nas etapas 1 e 2 do protocolo a seguir são realizadas em uma coifa estéril. Salvo indicação em contrário, todos os utensílios de plástico usados no capô estéril devem ser adquiridos esterilizados e selados ou esterilizados adequadamente por autoclave.

1. Iniciação da linhagem celular EA.hy926

  1. Adquira células EA.hy926.
  2. Armazene o(s) frasco(s) para injetáveis de células.......

Representative Results

O objetivo deste ensaio é geralmente produzir curvas de concentração-resposta (CRCs) para três a quatro novas parmodulinas. Em cada placa de ensaio, é frequentemente gerado um CRC adicional para um composto conhecido, como NRD-21, que atua como uma verificação de qualidade para o experimento devido ao seu IC50 conhecido. Para gerar CRCs, um mapa de placas como o representado na Tabela 1 deve ser planejado. Se, em vez disso, forem desejadas respostas de .......

Discussion

Enquanto o protocolo72 relatado anteriormente era geralmente confiável e nos permitia identificar uma nova parmodulina de chumbo, NRD-21,62 um protocolo mais eficiente era desejado. O ensaio foi ainda mais comprometido durante a escassez de suprimentos causada pela pandemia de COVID-19. A aquisição de ponteiras para o manipulador automatizado de líquidos tornou-se difícil, e a tentativa de lavar, esterilizar e reutilizar as ponteiras p.......

Disclosures

C.D. é inventor de patentes envolvendo parmodulinas e é o fundador e acionista da Function Therapeutics, Inc., que está desenvolvendo parmodulinas para uso clínico.

Acknowledgements

Agradecemos a Irene Hernandez, Trudy Holyst, Dr. Hartmut Weiler (Versiti Blood Research Institute) e Dr. Leggy Arnold (University of Wisconsin-Milwaukee) por fornecer espaço e apoio indireto a este projeto, e ao Dr. John McCorvy (Medical College of Wisconsin) pelos conselhos pertinentes. Agradecemos ao Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue (R15HL127636), ao Departamento de Defesa dos EUA (W81XWH22101) e à National Science Foundation (2223225) pelo apoio financeiro.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cellsATCCCRL-2922
CellStripper cell dissociation reagentCorning25-056-CITrypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol redCorning10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor97068-091
Gelatin from porcine skinMilliporeSigmaG2500Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)Corning30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)Corning25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Thermo172571000
Bovine serum albumin (BSA)Avantor97061-420
Calcium chloride dihydrateThermo42352-0250
Dimethyl sulfoxideThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)Corning21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrateMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
Sodium hydroxideVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plateCorning3603with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mLAvantor89039-664
Centrifuge tube, 50 mLAvantor89039-656
Culture flask, T-75Corning353136tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mLCorningRES-V-50-S
Enspire plate readerPerkin ElmerDiscontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mLAvantor20170-038
Pasteur pipette, 9"Fisher13-678-6Bmust be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap stripsAvantor76318-802
Pipette tips, 20 µLBiotix63300042sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µLBiotix63300044sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µLBiotix63300047sterile, filtered tips
PrismGraphPadvolume 6 used
Serological pipette, 5 mLTradewinds Direct 07-5005
Serological pipette, 10 mLTradewinds Direct 07-5010
Serological pipette, 25 mLTradewinds Direct 07-5025

References

  1. Rasmussen, U. B., et al. cDNA cloning and expression of a hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca2+ mobilization. FEBS Lett. 288 (1-2), 123-128 (1991).
  2. Vu, T. K., Hung, D. T., Wheaton, V. I., Coughlin, S. R.

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Keywords Mobiliza o de C lcioLeitor de PlacasC lcio IntracelularCorante FluorescenteFluo 4Receptor Ativado por Protease PARSinaliza o de Prote na GC lulas EndoteliaisEA hy926Ligantes PARParmodulinaTriagem de Alto Rendimento

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