Svelare le opportunità terapeutiche con i modelli di organoidi derivati dai pazienti con melanoma

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per generare organoidi derivati da pazienti affetti da melanoma coltivando sospensioni cellulari dissociate da tessuti freschi di melanoma. Questi organoidi ricapitolano fedelmente i tumori paziente-specifici in vitro, offrendo un approccio innovativo all'esplorazione dei meccanismi immunosoppressivi dei tumori, allo screening dei farmaci, ai meccanismi di resistenza ai farmaci e agli approcci di sorveglianza del cancro.

Abstract

Con lo sviluppo dell'immunoterapia, c'è una continua necessità di sviluppare modelli in grado di ricapitolare il microambiente tumorale dei tumori nativi. Mentre i modelli tradizionali bidimensionali e tridimensionali possono offrire informazioni sullo sviluppo e la progressione del cancro, questi mancano di aspetti cruciali che ostacolano una fedele imitazione dei tumori nativi. Un modello alternativo che ha guadagnato molta attenzione è l'organoide derivato dal paziente. Lo sviluppo di questi organoidi ricapitola la complessa comunicazione intercellulare, il microambiente tumorale e l'istoarchitettura dei tumori. Questo articolo descrive il protocollo per la creazione di modelli di organoidi derivati da pazienti con melanoma (MPDO). Per convalidare questi modelli, abbiamo valutato la composizione delle cellule immunitarie, compresi i livelli di espressione dei marcatori di attivazione delle cellule T, per confermare l'eterogeneità cellulare degli organoidi. Inoltre, per descrivere la potenziale utilità delle MPDO nelle terapie cellulari, abbiamo valutato le capacità citotossiche del trattamento degli organoidi con cellule T γδ. In conclusione, i modelli MPDO offrono strade promettenti per comprendere la complessità del tumore, convalidare le strategie terapeutiche e potenzialmente far progredire il trattamento personalizzato.

Introduction

I modelli convenzionali di coltura cellulare 2D sono strumenti essenziali nella ricerca sul cancro per studiare la progressione e la terapia del cancro¹. Questi modelli non solo consentono condizioni sperimentali controllate per studiare i meccanismi molecolari e cellulari alla base dello sviluppo e della progressione del cancro, ma forniscono anche risultati sperimentali economici e relativamente rapidi. Il loro utilizzo, tuttavia, è limitato a causa della limitata diversità cellulare nel microambiente tumorale (TME), che non può essere riassunta in una natura complanare dei modelli monocolturali

Protocol

I tessuti del melanoma umano sono stati ottenuti da pazienti in trattamento presso l'Università della Pennsylvania utilizzando il protocollo di raccolta dei tessuti (UPCC08607) approvato dall'Institutional Review Board dell'Università della Pennsylvania. Tutti i pazienti hanno firmato il consenso informato. Dopo la resezione dei tessuti del melanoma umano, il tessuto tumorale viene posto nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco e mantenuto a 4 °C fino al trattamento (entro 6 ore)........

Discussion

L'emergere delle PDO ha affrontato molteplici limitazioni poste da altri metodi di ricerca sul cancro precedentemente stabiliti, introducendo al contempo potenziali applicazioni trasformative nel campo. Questa tecnologia di organoidi è stata inizialmente proposta nel 2009 da Hans Clevers e colleghi, che sono stati in grado di stabilire con successo un sistema di coltura di organoidi intestinali coltivando cellule staminali Lgr5⁺ derivate dall'intestino di topi in un gel matri.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021