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Qui, presentiamo un protocollo per generare organoidi derivati da pazienti affetti da melanoma coltivando sospensioni cellulari dissociate da tessuti freschi di melanoma. Questi organoidi ricapitolano fedelmente i tumori paziente-specifici in vitro, offrendo un approccio innovativo all'esplorazione dei meccanismi immunosoppressivi dei tumori, allo screening dei farmaci, ai meccanismi di resistenza ai farmaci e agli approcci di sorveglianza del cancro.
Con lo sviluppo dell'immunoterapia, c'è una continua necessità di sviluppare modelli in grado di ricapitolare il microambiente tumorale dei tumori nativi. Mentre i modelli tradizionali bidimensionali e tridimensionali possono offrire informazioni sullo sviluppo e la progressione del cancro, questi mancano di aspetti cruciali che ostacolano una fedele imitazione dei tumori nativi. Un modello alternativo che ha guadagnato molta attenzione è l'organoide derivato dal paziente. Lo sviluppo di questi organoidi ricapitola la complessa comunicazione intercellulare, il microambiente tumorale e l'istoarchitettura dei tumori. Questo articolo descrive il protocollo per la creazione di modelli di organoidi derivati da pazienti con melanoma (MPDO). Per convalidare questi modelli, abbiamo valutato la composizione delle cellule immunitarie, compresi i livelli di espressione dei marcatori di attivazione delle cellule T, per confermare l'eterogeneità cellulare degli organoidi. Inoltre, per descrivere la potenziale utilità delle MPDO nelle terapie cellulari, abbiamo valutato le capacità citotossiche del trattamento degli organoidi con cellule T γδ. In conclusione, i modelli MPDO offrono strade promettenti per comprendere la complessità del tumore, convalidare le strategie terapeutiche e potenzialmente far progredire il trattamento personalizzato.
I modelli convenzionali di coltura cellulare 2D sono strumenti essenziali nella ricerca sul cancro per studiare la progressione e la terapia del cancro1. Questi modelli non solo consentono condizioni sperimentali controllate per studiare i meccanismi molecolari e cellulari alla base dello sviluppo e della progressione del cancro, ma forniscono anche risultati sperimentali economici e relativamente rapidi. Il loro utilizzo, tuttavia, è limitato a causa della limitata diversità cellulare nel microambiente tumorale (TME), che non può essere riassunta in una natura complanare dei modelli monocolturali
I tessuti del melanoma umano sono stati ottenuti da pazienti in trattamento presso l'Università della Pennsylvania utilizzando il protocollo di raccolta dei tessuti (UPCC08607) approvato dall'Institutional Review Board dell'Università della Pennsylvania. Tutti i pazienti hanno firmato il consenso informato. Dopo la resezione dei tessuti del melanoma umano, il tessuto tumorale viene posto nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco e mantenuto a 4 °C fino al trattamento (entro 6 ore)........
La forma e le dimensioni delle MPDO sono state monitorate nel tempo per studiarne le dinamiche di crescita. Come si vede nella Figura 2, durante il periodo di crescita iniziale, la dimensione dell'organoide è aumentata sostanzialmente durante i 7 giorni raffigurati. A seguito dell'osservazione delle dinamiche di crescita dell'MPDO, l'attenzione si è rivolta alla valutazione della composizione delle cellule immunitarie per verificare la fedele ricapitolazio.......
L'emergere delle PDO ha affrontato molteplici limitazioni poste da altri metodi di ricerca sul cancro precedentemente stabiliti, introducendo al contempo potenziali applicazioni trasformative nel campo. Questa tecnologia di organoidi è stata inizialmente proposta nel 2009 da Hans Clevers e colleghi, che sono stati in grado di stabilire con successo un sistema di coltura di organoidi intestinali coltivando cellule staminali Lgr5+ derivate dall'intestino di topi in un gel matri.......
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Questo studio è stato finanziato in parte da sovvenzioni di R01 (CA258113), SPORE (CA261608) e P01 (CA114046). La Figura 1 è stata preparata nel BioRender.com.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 431420 | |
50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352070 | |
100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
105 mm Polystyrene Forceps Sterile | Caplugs Evergreen | 222-1121-B1I | |
150 cm2 Cell Culture Flask | Corning | CLS430825 | |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1) | Gibco | 12634-010 | |
B-27 Supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody | BioLegend | 308120 | |
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody | BioLegend | 350522 | |
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody | BioLegend | 345028 | |
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 304050 | |
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter | Millipore Sigma | PIHP03050 | |
Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
Collagenase, Type IV, powder | Gibco | 17104019 | |
Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile | Max Scientific | 07-6048 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL | Corning | MT10-0130CV | |
Dnase I - Grade II | Millipore Sigma | 10104159001 | |
DPBS, 1% | Corning | 21-031-CV | |
Fetal Bovine Serum, FBS | Corning | MT35-010-CV | |
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | 556547 | |
Forskolin | Tocris | 1099 | |
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10131035 | |
GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
Ham's F12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11765054 | |
HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
Hygromycin B (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10687010 | |
L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
L-WRN cell | ATCC | CRL-3276 | |
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced | Corning | 356231 | |
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM | Millipore Sigma | SLGVR33RB | |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask | ThermoFisher | 132867 | |
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301010 | |
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD Biosciences | 561272 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15-1MG | |
Recombinant Human FGF-acidic | Peprotech | 100-17A | |
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%) | Quality Biological | 118-085-721 | |
Stainless Steel Surgical Blades no. 22 | Integra | 4-322 | |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 |
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