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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per generare organoidi derivati da pazienti affetti da melanoma coltivando sospensioni cellulari dissociate da tessuti freschi di melanoma. Questi organoidi ricapitolano fedelmente i tumori paziente-specifici in vitro, offrendo un approccio innovativo all'esplorazione dei meccanismi immunosoppressivi dei tumori, allo screening dei farmaci, ai meccanismi di resistenza ai farmaci e agli approcci di sorveglianza del cancro.

Abstract

Con lo sviluppo dell'immunoterapia, c'è una continua necessità di sviluppare modelli in grado di ricapitolare il microambiente tumorale dei tumori nativi. Mentre i modelli tradizionali bidimensionali e tridimensionali possono offrire informazioni sullo sviluppo e la progressione del cancro, questi mancano di aspetti cruciali che ostacolano una fedele imitazione dei tumori nativi. Un modello alternativo che ha guadagnato molta attenzione è l'organoide derivato dal paziente. Lo sviluppo di questi organoidi ricapitola la complessa comunicazione intercellulare, il microambiente tumorale e l'istoarchitettura dei tumori. Questo articolo descrive il protocollo per la creazione di modelli di organoidi derivati da pazienti con melanoma (MPDO). Per convalidare questi modelli, abbiamo valutato la composizione delle cellule immunitarie, compresi i livelli di espressione dei marcatori di attivazione delle cellule T, per confermare l'eterogeneità cellulare degli organoidi. Inoltre, per descrivere la potenziale utilità delle MPDO nelle terapie cellulari, abbiamo valutato le capacità citotossiche del trattamento degli organoidi con cellule T γδ. In conclusione, i modelli MPDO offrono strade promettenti per comprendere la complessità del tumore, convalidare le strategie terapeutiche e potenzialmente far progredire il trattamento personalizzato.

Introduction

I modelli convenzionali di coltura cellulare 2D sono strumenti essenziali nella ricerca sul cancro per studiare la progressione e la terapia del cancro1. Questi modelli non solo consentono condizioni sperimentali controllate per studiare i meccanismi molecolari e cellulari alla base dello sviluppo e della progressione del cancro, ma forniscono anche risultati sperimentali economici e relativamente rapidi. Il loro utilizzo, tuttavia, è limitato a causa della limitata diversità cellulare nel microambiente tumorale (TME), che non può essere riassunta in una natura complanare dei modelli monocolturali

Protocol

I tessuti del melanoma umano sono stati ottenuti da pazienti in trattamento presso l'Università della Pennsylvania utilizzando il protocollo di raccolta dei tessuti (UPCC08607) approvato dall'Institutional Review Board dell'Università della Pennsylvania. Tutti i pazienti hanno firmato il consenso informato. Dopo la resezione dei tessuti del melanoma umano, il tessuto tumorale viene posto nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco e mantenuto a 4 °C fino al trattamento (entro 6 ore)........

Representative Results

La forma e le dimensioni delle MPDO sono state monitorate nel tempo per studiarne le dinamiche di crescita. Come si vede nella Figura 2, durante il periodo di crescita iniziale, la dimensione dell'organoide è aumentata sostanzialmente durante i 7 giorni raffigurati. A seguito dell'osservazione delle dinamiche di crescita dell'MPDO, l'attenzione si è rivolta alla valutazione della composizione delle cellule immunitarie per verificare la fedele ricapitolazio.......

Discussion

L'emergere delle PDO ha affrontato molteplici limitazioni poste da altri metodi di ricerca sul cancro precedentemente stabiliti, introducendo al contempo potenziali applicazioni trasformative nel campo. Questa tecnologia di organoidi è stata inizialmente proposta nel 2009 da Hans Clevers e colleghi, che sono stati in grado di stabilire con successo un sistema di coltura di organoidi intestinali coltivando cellule staminali Lgr5+ derivate dall'intestino di topi in un gel matri.......

Acknowledgements

Questo studio è stato finanziato in parte da sovvenzioni di R01 (CA258113), SPORE (CA261608) e P01 (CA114046). La Figura 1 è stata preparata nel BioRender.com.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic VialCorning431420
50 mL Polypropylene Conical TubeCorning352070
100 mm TC-treated Cell Culture DishCorning353003
105 mm Polystyrene Forceps SterileCaplugs Evergreen 222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture FlaskCorningCLS430825
A83-01Tocris2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)Gibco12634-010
B-27 Supplement (50x)Gibco17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin AntibodyBioLegend308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 AntibodyBioLegend350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) AntibodyBioLegend345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 AntibodyBioLegend304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm DiameterMillipore SigmaPIHP03050
Cell Staining BufferBioLegend420201
Cell Strainer 40 µm NylonCorning 352340
Cell Strainer 70 µm NylonCorning 352350
Collagenase, Type IV, powderGibco17104019
Cultrex Rat Collagen ITrevigen3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterileMax Scientific 07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-MaxSigma-AldrichD2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mLCorningMT10-0130CV
Dnase I - Grade IIMillipore Sigma10104159001
DPBS, 1% Corning21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBSCorningMT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit IBD Biosciences 556547
ForskolinTocris1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)ThermoFisher10131035
GlutaMAX SupplementThermoFisher35050061
Ham's F12 Nutrient MixThermoFisher11765054
HEPES (1 M)Gibco15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)ThermoFisher10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
L-WRN cellATCCCRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. ReducedCorning356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μMMillipore SigmaSLGVR33RB
N-AcetylcysteineSigma-AldrichA9165-5G
NicotinamideSigma-AldrichN0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture FlaskThermoFisher132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a AntibodyBioLegend301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)BD Biosciences 561272
Pen StrepGibco15140-122
Recombinant Human EGFPeprotechAF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidicPeprotech100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)Quality Biological 118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22Integra4-322
TrypLE Express Gibco12604-021

References

  1. Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer Cell Lines Are Useful Model Systems for Medical Research. Cancers (Basel). 11 (8), 1098 (2019).
  2. Shannon, A. E., Boos, C. E., Hummon, A. B. ....

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