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Aqui, apresentamos um protocolo para gerar organoides derivados de pacientes com melanoma por meio da cultura de suspensões de células dissociadas de tecidos frescos de melanoma. Esses organoides recapitulam fielmente tumores específicos do paciente in vitro, oferecendo uma abordagem inovadora para explorar mecanismos imunossupressores tumorais, triagem de drogas, mecanismos de resistência a drogas e abordagens de vigilância do câncer.
Com o desenvolvimento da imunoterapia, há uma necessidade contínua de desenvolver modelos que possam recapitular o microambiente tumoral de tumores nativos. Embora os modelos bidimensionais e tridimensionais tradicionais possam oferecer insights sobre o desenvolvimento e a progressão do câncer, eles carecem de aspectos cruciais que impeçam uma imitação fiel dos tumores nativos. Um modelo alternativo que ganhou muita atenção é o organoide derivado do paciente. O desenvolvimento desses organoides recapitula a complexa comunicação intercelular, o microambiente tumoral e a histoarquitetura dos tumores. Este artigo descreve o protocolo para estabelecer modelos de organoides derivados de pacientes com melanoma (MPDO). Para validar esses modelos, avaliamos a composição das células imunes, incluindo os níveis de expressão de marcadores de ativação de células T, para confirmar a heterogeneidade celular dos organoides. Além disso, para descrever a utilidade potencial dos MPDOs em terapias celulares, avaliamos as capacidades citotóxicas do tratamento dos organoides com células T γδ. Em conclusão, os modelos MPDO oferecem caminhos promissores para entender a complexidade do tumor, validar estratégias terapêuticas e potencialmente avançar no tratamento personalizado.
Modelos convencionais de cultura de células 2-D são ferramentas essenciais na pesquisa do câncer para estudar a progressão e a terapia do câncer1. Esses modelos não apenas permitem condições experimentais controladas para investigar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes ao desenvolvimento e progressão do câncer, mas também fornecem resultados experimentais econômicos e relativamente rápidos. Seu uso, no entanto, é restrito devido à limitada diversidade celular no microambiente tumoral (TME), que não pode ser recapitulada em uma natureza coplanar de modelos de monocultura2. Al....
Os tecidos de melanoma humano foram obtidos de pacientes em tratamento na Universidade da Pensilvânia usando o protocolo de coleta de tecidos (UPCC08607) aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Pensilvânia. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Após a ressecção dos tecidos do melanoma humano, o tecido tumoral é colocado no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) e mantido a 4 °C até o processamento (dentro de 6 .......
A forma e o tamanho dos MPDOs foram monitorados ao longo do tempo para estudar sua dinâmica de crescimento. Como visto na Figura 2, durante o período inicial de crescimento, o tamanho do organoide aumentou substancialmente ao longo dos 7 dias representados. Após a observação da dinâmica de crescimento do MPDO, a atenção voltou-se para a avaliação da composição das células imunes para verificar a recapitulação fiel dos organoides aos tumores or.......
O surgimento de PDOs abordou várias limitações impostas por outros métodos de pesquisa de câncer previamente estabelecidos, ao mesmo tempo em que introduziu aplicações potenciais transformadoras no campo. Essa tecnologia organoide foi inicialmente proposta em 2009 por Hans Clevers e colegas, que conseguiram estabelecer com sucesso um sistema de cultura organoide intestinal cultivando células-tronco Lgr5+ derivadas do intestino de camundongos em um gel de matriz 3D cont.......
Este estudo foi financiado em parte por doações do R01 (CA258113), SPORE (CA261608) e P01 (CA114046). A Figura 1 foi elaborada em BioRender.com.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 431420 | |
50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352070 | |
100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
105 mm Polystyrene Forceps Sterile | Caplugs Evergreen | 222-1121-B1I | |
150 cm2 Cell Culture Flask | Corning | CLS430825 | |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1) | Gibco | 12634-010 | |
B-27 Supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody | BioLegend | 308120 | |
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody | BioLegend | 350522 | |
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody | BioLegend | 345028 | |
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 304050 | |
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter | Millipore Sigma | PIHP03050 | |
Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
Collagenase, Type IV, powder | Gibco | 17104019 | |
Cultrex Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile | Max Scientific | 07-6048 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL | Corning | MT10-0130CV | |
Dnase I - Grade II | Millipore Sigma | 10104159001 | |
DPBS, 1% | Corning | 21-031-CV | |
Fetal Bovine Serum, FBS | Corning | MT35-010-CV | |
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | 556547 | |
Forskolin | Tocris | 1099 | |
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10131035 | |
GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
Ham's F12 Nutrient Mix | ThermoFisher | 11765054 | |
HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
Hygromycin B (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10687010 | |
L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
L-WRN cell | ATCC | CRL-3276 | |
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced | Corning | 356231 | |
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM | Millipore Sigma | SLGVR33RB | |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask | ThermoFisher | 132867 | |
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody | BioLegend | 301010 | |
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1) | BD Biosciences | 561272 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15-1MG | |
Recombinant Human FGF-acidic | Peprotech | 100-17A | |
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%) | Quality Biological | 118-085-721 | |
Stainless Steel Surgical Blades no. 22 | Integra | 4-322 | |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 |
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