Revelando oportunidades terapêuticas com modelos organoides derivados de pacientes com melanoma

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar organoides derivados de pacientes com melanoma por meio da cultura de suspensões de células dissociadas de tecidos frescos de melanoma. Esses organoides recapitulam fielmente tumores específicos do paciente in vitro, oferecendo uma abordagem inovadora para explorar mecanismos imunossupressores tumorais, triagem de drogas, mecanismos de resistência a drogas e abordagens de vigilância do câncer.

Abstract

Com o desenvolvimento da imunoterapia, há uma necessidade contínua de desenvolver modelos que possam recapitular o microambiente tumoral de tumores nativos. Embora os modelos bidimensionais e tridimensionais tradicionais possam oferecer insights sobre o desenvolvimento e a progressão do câncer, eles carecem de aspectos cruciais que impeçam uma imitação fiel dos tumores nativos. Um modelo alternativo que ganhou muita atenção é o organoide derivado do paciente. O desenvolvimento desses organoides recapitula a complexa comunicação intercelular, o microambiente tumoral e a histoarquitetura dos tumores. Este artigo descreve o protocolo para estabelecer modelos de organoides derivados de pacientes com melanoma (MPDO). Para validar esses modelos, avaliamos a composição das células imunes, incluindo os níveis de expressão de marcadores de ativação de células T, para confirmar a heterogeneidade celular dos organoides. Além disso, para descrever a utilidade potencial dos MPDOs em terapias celulares, avaliamos as capacidades citotóxicas do tratamento dos organoides com células T γδ. Em conclusão, os modelos MPDO oferecem caminhos promissores para entender a complexidade do tumor, validar estratégias terapêuticas e potencialmente avançar no tratamento personalizado.

Introduction

Modelos convencionais de cultura de células 2-D são ferramentas essenciais na pesquisa do câncer para estudar a progressão e a terapia do câncer¹. Esses modelos não apenas permitem condições experimentais controladas para investigar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes ao desenvolvimento e progressão do câncer, mas também fornecem resultados experimentais econômicos e relativamente rápidos. Seu uso, no entanto, é restrito devido à limitada diversidade celular no microambiente tumoral (TME), que não pode ser recapitulada em uma natureza coplanar de modelos de monocultura². Al....

Protocol

Os tecidos de melanoma humano foram obtidos de pacientes em tratamento na Universidade da Pensilvânia usando o protocolo de coleta de tecidos (UPCC08607) aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Pensilvânia. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Após a ressecção dos tecidos do melanoma humano, o tecido tumoral é colocado no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) e mantido a 4 °C até o processamento (dentro de 6 .......

Discussion

O surgimento de PDOs abordou várias limitações impostas por outros métodos de pesquisa de câncer previamente estabelecidos, ao mesmo tempo em que introduziu aplicações potenciais transformadoras no campo. Essa tecnologia organoide foi inicialmente proposta em 2009 por Hans Clevers e colegas, que conseguiram estabelecer com sucesso um sistema de cultura organoide intestinal cultivando células-tronco Lgr5⁺ derivadas do intestino de camundongos em um gel de matriz 3D cont.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Red Cap Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	431420
50 mL Polypropylene Conical Tube	Corning	352070
100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
105 mm Polystyrene Forceps Sterile	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 anti-human Perforin Antibody	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 anti-human Ki-67 Antibody	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 anti-human CD366 (Tim-3) Antibody	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304050
Cell Culture Inserts 0.4 µm, 30 mm Diameter	Millipore Sigma	PIHP03050
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Cell Strainer 40 µm Nylon	Corning	352340
Cell Strainer 70 µm Nylon	Corning	352350
Collagenase, Type IV, powder	Gibco	17104019
Cultrex Rat Collagen I	Trevigen	3440-100-01
Culture Plate, PS, 48 wells, TC treated with lid, sterile	Max Scientific	07-6048
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - high glucose 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
Dnase I - Grade II	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
Fetal Bovine Serum, FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	556547
Forskolin	Tocris	1099
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hygromycin B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN cell	ATCC	CRL-3276
Matrigel Phenol Free & Growth Fact. Reduced	Corning	356231
Millex PVDF syringe filter, 0.22 μM	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask Treated Cell Culture Flask	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 anti-human CD8a Antibody	BioLegend	301010
PE-Cy 7 Mouse anti-Human CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
Pen Strep	Gibco	15140-122
Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
Recombinant Human FGF-acidic	Peprotech	100-17A
Sodium Bicarbonate Solution (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
Stainless Steel Surgical Blades no. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021