Måling af endoplasmatisk retikulumstress og udfoldet proteinrespons i HIV-1-inficerede T-celler og analyse af dens rolle i HIV-1-replikation

Virusinfektioner kan forårsage endoplasmatisk retikulum (ER) stress på grund af unormal proteinophobning, hvilket fører til udfoldet proteinrespons (UPR). Vira har udviklet strategier til at manipulere værts-UPR, men der mangler en detaljeret forståelse af UPR-modulation og dens funktionelle betydning under HIV-1-infektion i litteraturen. I denne sammenhæng beskriver den aktuelle artikel de protokoller, der bruges i vores laboratorium til at måle ER-stressniveauer og UPR under HIV-1-infektion i T-celler og effekten af UPR på viral replikation og infektivitet.

Thioflavin T (ThT)-farvning er en relativt ny metode, der bruges til at detektere ER-stress i cellerne ved at detektere proteinaggregater. Her har vi illustreret protokollen for ThT-farvning i HIV-1-inficerede celler for at opdage og kvantificere ER-stress. Desuden blev ER-stress også påvist indirekte ved at måle niveauerne af UPR-markører såsom BiP, phosphoryleret IRE1, PERK og eIF2α, splejsning af XBP1, spaltning af ATF6, ATF4, CHOP og GADD34 i HIV-1-inficerede celler ved hjælp af konventionel immunoblotting og kvantitativ revers transkriptionspolymerasekædereaktion (RT-PCR). Vi har fundet ud af, at ThT-fluorescensen korrelerer med indikatorerne for UPR-aktivering. Denne artikel demonstrerer også protokollerne til at analysere virkningen af ER-stress og UPR-modulation på HIV-1-replikation ved knockdown-eksperimenter samt brugen af farmakologiske molekyler. Effekten af UPR på HIV-1-genekspression/replikation og virusproduktion blev analyseret ved henholdsvis Luciferase reporter-assays og p24-antigenfangst ELISA, mens effekten på virion-infektivitet blev analyseret ved farvning af inficerede reporterceller. Samlet set giver dette sæt metoder en omfattende forståelse af Unfolded Protein Response-vejene under HIV-1-infektion og afslører dens indviklede dynamik.