Messung des Stresses des endoplasmatischen Retikulums und der entfalteten Proteinantwort in HIV-1-infizierten T-Zellen und Analyse seiner Rolle bei der HIV-1-Replikation

Virusinfektionen können aufgrund einer abnormalen Proteinakkumulation Stress im endoplasmatischen Retikulum (ER) verursachen, was zu einer ungefalteten Proteinantwort (UPR) führt. Viren haben Strategien entwickelt, um die UPR des Wirts zu manipulieren, aber es fehlt in der Literatur an einem detaillierten Verständnis der UPR-Modulation und ihrer funktionellen Bedeutung während einer HIV-1-Infektion. In diesem Zusammenhang beschreibt der vorliegende Artikel die in unserem Labor verwendeten Protokolle zur Messung des ER-Stressniveaus und der UPR während einer HIV-1-Infektion in T-Zellen sowie die Wirkung der UPR auf die Virusreplikation und Infektiosität.

Die Thioflavin-T-Färbung (ThT) ist eine relativ neue Methode, die zum Nachweis von ER-Stress in den Zellen durch den Nachweis von Proteinaggregaten verwendet wird. Hier haben wir das Protokoll für die ThT-Färbung in HIV-1-infizierten Zellen zum Nachweis und zur Quantifizierung von ER-Stress veranschaulicht. Darüber hinaus wurde ER-Stress auch indirekt nachgewiesen, indem die Spiegel von UPR-Markern wie BiP, phosphoryliertem IRE1, PERK und eIF2α, das Spleißen von XBP1, die Spaltung von ATF6, ATF4, CHOP und GADD34 in HIV-1-infizierten Zellen unter Verwendung von konventionellem Immunblotting und quantitativer reverser Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) gemessen wurden. Wir haben festgestellt, dass die ThT-Fluoreszenz mit den Indikatoren der UPR-Aktivierung korreliert. In diesem Artikel werden auch die Protokolle zur Analyse des Einflusses von ER-Stress und UPR-Modulation auf die HIV-1-Replikation durch Knockdown-Experimente sowie die Verwendung pharmakologischer Moleküle vorgestellt. Die Wirkung von UPR auf die HIV-1-Genexpression/-replikation und die Virusproduktion wurde mittels Luciferase-Reporterassays bzw. p24-Antigen-Capture-ELISA analysiert, während die Wirkung auf die Infektiosität der Virionen durch Färbung infizierter Reporterzellen analysiert wurde. Insgesamt bietet dieser Methodensatz ein umfassendes Verständnis der entfalteten Proteinantwortwege während einer HIV-1-Infektion und enthüllt seine komplizierte Dynamik.