מדידת לחץ רשתית אנדופלסמית ותגובת חלבון פתוחה בתאי T נגועים ב- HIV-1 וניתוח תפקידה בשכפול HIV-1

זיהומים נגיפיים עלולים לגרום ללחץ של רטיקולום אנדופלסמי (ER) עקב הצטברות חלבון חריגה, מה שמוביל לתגובת חלבון מקופלת (UPR). וירוסים פיתחו אסטרטגיות כדי לתפעל את UPR המארח, אבל יש חוסר הבנה מפורטת של אפנון UPR ואת המשמעות התפקודית שלה במהלך זיהום HIV-1 בספרות. בהקשר זה, המאמר הנוכחי מתאר את הפרוטוקולים המשמשים במעבדה שלנו למדידת רמות לחץ בחדר מיון ו- UPR במהלך זיהום HIV-1 בתאי T ואת ההשפעה של UPR על שכפול ויראלי והדבקה.

צביעת תיאופלבין T (ThT) היא שיטה חדשה יחסית המשמשת לזיהוי עקה בחדר מיון בתאים על ידי איתור צברי חלבונים. כאן, הדגמנו את הפרוטוקול לצביעת ThT בתאים נגועים ב- HIV-1 כדי לזהות ולכמת לחץ במיון. יתר על כן, מתח ER זוהה גם בעקיפין על ידי מדידת רמות של סמני UPR כגון BiP, IRE1 זרחני, PERK ו- eIF2α, שחבור של XBP1, מחשוף של ATF6, ATF4, CHOP ו- GADD34 בתאים נגועים ב- HIV-1, באמצעות אימונובלוטינג קונבנציונלי ותגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק לאחור (RT-PCR). מצאנו כי ThT-fluorescence מתואם עם האינדיקטורים של הפעלת UPR. מאמר זה גם מדגים את הפרוטוקולים לניתוח ההשפעה של לחץ ER ומודולציית UPR על שכפול HIV-1 על ידי ניסויי הפלה, כמו גם שימוש במולקולות פרמקולוגיות. ההשפעה של UPR על ביטוי / שכפול גנים של HIV-1 וייצור וירוסים נותחה על ידי מבחני כתב Luciferase ו- p24 antigen capture ELISA, בהתאמה, ואילו ההשפעה על זיהום ויריונים נותחה על ידי צביעה של תאי דיווח נגועים. באופן קולקטיבי, קבוצה זו של שיטות מספקת הבנה מקיפה של מסלולי תגובת החלבונים שנפרשו במהלך זיהום HIV-1, וחושפת את הדינמיקה המורכבת שלה.