Måling av endoplasmatisk retikulumstress og utfoldet proteinrespons i HIV-1-infiserte T-celler og analyse av dens rolle i HIV-1-replikasjon

Virusinfeksjoner kan forårsake endoplasmatisk retikulum (ER) stress på grunn av unormal proteinakkumulering, noe som fører til utfoldet proteinrespons (UPR). Virus har utviklet strategier for å manipulere verts-UPR, men det er mangel på detaljert forståelse av UPR-modulering og dens funksjonelle betydning under HIV-1-infeksjon i litteraturen. I denne sammenhengen beskriver denne artikkelen protokollene som brukes i laboratoriet vårt for å måle ER-stressnivåer og UPR under HIV-1-infeksjon i T-celler og effekten av UPR på viral replikasjon og smittsomhet.

Tioflavin T (ThT)-farging er en relativt ny metode som brukes til å oppdage ER-stress i cellene ved å oppdage proteinaggregater. Her har vi illustrert protokollen for ThT-farging i HIV-1-infiserte celler for å oppdage og kvantifisere ER-stress. Videre ble ER-stress også oppdaget indirekte ved å måle nivåene av UPR-markører som BiP, fosforylert IRE1, PERK og eIF2α, skjøting av XBP1, spaltning av ATF6, ATF4, CHOP og GADD34 i HIV-1-infiserte celler, ved bruk av konvensjonell immunoblotting og kvantitativ revers transkripsjonspolymerasekjedereaksjon (RT-PCR). Vi har funnet at ThT-fluorescensen korrelerer med indikatorene for UPR-aktivering. Denne artikkelen demonstrerer også protokollene for å analysere virkningen av ER-stress og UPR-modulering på HIV-1-replikasjon ved knockdown-eksperimenter samt bruk av farmakologiske molekyler. Effekten av UPR på HIV-1-genekspresjon/replikasjon og virusproduksjon ble analysert ved henholdsvis Luciferase-reporteranalyser og p24-antigenfangst-ELISA, mens effekten på virionsmittsomhet ble analysert ved farging av infiserte reporterceller. Samlet gir dette settet med metoder en omfattende forståelse av Unfolded Protein Response-veiene under HIV-1-infeksjon, og avslører dens intrikate dynamikk.