Medindo o estresse do retículo endoplasmático e a resposta da proteína desdobrada em células T infectadas pelo HIV-1 e analisando seu papel na replicação do HIV-1

As infecções virais podem causar estresse no retículo endoplasmático (RE) devido ao acúmulo anormal de proteínas, levando à resposta proteica desdobrada (UPR). Os vírus desenvolveram estratégias para manipular a RPU do hospedeiro, mas há uma falta de compreensão detalhada da modulação da RPU e seu significado funcional durante a infecção pelo HIV-1 na literatura. Nesse contexto, o presente artigo descreve os protocolos utilizados em nosso laboratório para medir os níveis de estresse do RE e UPR durante a infecção pelo HIV-1 em células T e o efeito da UPR na replicação viral e infectividade.

A coloração com tioflavina T (ThT) é um método relativamente novo usado para detectar o estresse do ER nas células, detectando agregados de proteínas. Aqui, ilustramos o protocolo de coloração ThT em células infectadas pelo HIV-1 para detectar e quantificar o estresse do RE. Além disso, o estresse do RE também foi detectado indiretamente medindo os níveis de marcadores UPR como BiP, IRE1 fosforilado, PERK e eIF2α, splicing de XBP1, clivagem de ATF6, ATF4, CHOP e GADD34 em células infectadas pelo HIV-1, usando immunoblotting convencional e reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (RT-PCR). Descobrimos que a fluorescência ThT se correlaciona com os indicadores de ativação da UPR. Este artigo também demonstra os protocolos para analisar o impacto do estresse do RE e da modulação da UPR na replicação do HIV-1 por meio de experimentos de knockdown, bem como o uso de moléculas farmacológicas. O efeito da UPR na expressão/replicação do gene HIV-1 e na produção do vírus foi analisado por ensaios repórter de luciferase e ELISA de captura do antígeno p24, respectivamente, enquanto o efeito na infectividade do vírion foi analisado pela coloração de células repórter infectadas. Coletivamente, este conjunto de métodos fornece uma compreensão abrangente das vias de resposta proteica desdobrada durante a infecção pelo HIV-1, revelando sua intrincada dinâmica.