Измерение стресса эндоплазматического ретикулума и развернутого белкового ответа в Т-клетках, инфицированных ВИЧ-1, и анализ его роли в репликации ВИЧ-1

Summary

В данной статье мы описываем некоторые установленные методы определения стресса эндоплазматического ретикулума (ЭР) и активации развернутого белкового ответа (УПО), уделяя особое внимание инфекции ВИЧ-1. В этой статье также описывается набор протоколов для исследования влияния стресса ER/UPR на репликацию ВИЧ-1 и инфекционность вириона.

Abstract

Вирусные инфекции могут вызывать стресс эндоплазматического ретикулума (ЭР) из-за аномального накопления белка, что приводит к развернутому белковому ответу (UPR). Вирусы разработали стратегии манипулирования UPR хозяина, но в литературе отсутствует подробное понимание модуляции UPR и ее функционального значения во время инфекции ВИЧ-1. В этом контексте в настоящей статье описываются протоколы, используемые в нашей лаборатории для измерения уровней стресса ER и UPR во время инфекции ВИЧ-1 в Т-клетках, а также влияние UPR на репликацию вируса и инфекционность.

Окрашивание тиофлавином Т (ThT) является относительно новым методом, используемым для обнаружения ER-стресса в клетках путем обнаружения белковых агрегатов. Здесь мы проиллюстрировали протокол окрашивания ThT в инфицированных ВИЧ-1 клетках для выявления и количественного определения ER-стресса. Кроме того, стресс ER также был обнаружен косвенно путем измерения уровней маркеров UPR, таких как BiP, фосфорилированный IRE1, PERK и eIF2α, сплайсинга XBP1, расщепления ATF6, ATF4, CHOP и GADD34 в инфицированных клетках ВИЧ-1, с использованием обычного иммуноблоттинга и количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Установлено, что ThT-флуоресценция коррелирует с показателями активации UPR. В данной статье также демонстрируются протоколы анализа влияния стресса ER и модуляции УПО на репликацию ВИЧ-1 с помощью нокдаун-экспериментов, а также использования фармакологических молекул. Влияние УПО на экспрессию/репликацию гена ВИЧ-1 и продукцию вируса анализировали с помощью репортерного анализа люциферазы и ИФА захвата антигена р24 соответственно, тогда как влияние на инфекционность вириона анализировали путем окрашивания инфицированных репортерных клеток. В совокупности этот набор методов обеспечивает всестороннее понимание путей ответа развернутого белка во время инфекции ВИЧ-1, раскрывая его сложную динамику.

Introduction

Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) характеризуется постепенным снижением количества CD4⁺ Т-лимфоцитов, что приводит к прогрессирующему провалу иммунного ответа. Вирус иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1) является возбудителем СПИДа. Это оболочечный одноцепочечный РНК-вирус с двумя копиями РНК на вирион, принадлежащий к семейству ретровирид. Производство высоких концентраций вирусных белков в клетке-хозяине создает чрезмерную нагрузку на механизм сворачивания белка в клетке¹. ER является первым компартментом в секреторном пути эукариотических клеток. Он отвечает за производство, изменение и дос....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используются клеточные линии HEK-293T и Jurkat J6 (клеточная линия CD4+T), которые были получены из Cell Repository, NCCS, Пуна, Индия; TZM-bl, клеточная линия, полученная из HeLa, которая интегрировала копии генов β-галактозидазы и люциферазы в промотор²⁴ длинного .......

Discussion

Сфера применения настоящего протокола включает в себя: (i) обработку запасов вируса ВИЧ-1 и измерение концентрации вируса и инфекционности вириона, (ii) инфицирование Т-клеток ВИЧ-1 и оценку его влияния на стресс ER и различные маркеры УПО, (iii) влияние нокдауна маркеров УПО.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamamide	Biorad, USA	1610107
Agarose	G-Biosciences, USA	RC1013
Ammonium persulphate	Sigma-Aldrich, USA	A3678
anti-ATF4 antibody	Cell Signaling Technology, USA	11815	Western blot detection Dilution-1:1000
anti-ATF6 antibody	Abcam, UK	ab122897	Western blot detection Dilution-1:1000
anti-CHOP antibody	Cell Signaling Technology, USA	2897	Western blot detection Dilution-1:1000
anti-eIF2α antibody	Santa Cruz Biotechnology, USA	sc-11386	Western blot detection Dilution-1:2000
anti-GADD34 antibody	Abcam, UK	ab236516	Western blot detection Dilution-1:1000
anti-GAPDH antibody	Santa Cruz Biotechnology, USA	sc-32233	Western blot detection Dilution-1:3000
anti-HSPA5 antibody	Cell Signaling Technology, USA	3177	Western blot detection Dilution-1:1000
anti-IRE1 antibody	Cell Signaling Technology, USA	3294	Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-mouse HRP conjugate antibody	Biorad, USA	1706516	Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-peIF2α antibody	Invitrogen, USA	44-728G	Western blot detection Dilution-1:1000
anti-PERK antibody	Cell Signaling Technology, USA	5683	Western blot detection Dilution-1:2000
anti-pIRE1 antibody	Abcam, UK	ab243665	Western blot detection Dilution-1:1000
anti-pPERK antibody	Invitrogen, USA	PA5-40294	Western blot detection Dilution-1:2000
Anti-rabbit HRP conjugate antibody	Biorad, USA	1706515	Western blot detection Dilution- 1:4000
anti-XBP1 antibody	Abcam, UK	ab37152	Western blot detection Dilution-1:1000
Bench top high speed centrifuge	Eppendorf, USA	5804R	Rotor- F-45-30-11
Bench top low speed centrifuge	Eppendorf, USA	5702R	Rotor- A-4-38
Bis-Acrylamide	Biorad, USA	1610201
Bovine Serum Albumin (BSA)	MP biomedicals, USA	160069
Bradford reagent	Biorad, USA	5000006
CalPhos mammalian Transfection kit	Clontech, Takara Bio, USA	631312	Virus stock preparation
CEM-GFP	NIH, AIDS Repository, USA	3655
Clarity ECL substrate	Biorad, USA	1705061	chemiluminescence detecting substrate
Clarity max ECL substrate	Biorad, USA	1705062	chemiluminescence detecting substrate
Confocal laser scanning microscope	Olympus, Japan	Model:FV3000
Cytospin centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA	ASHA78300003
DMEM	Invitrogen, USA	11995073
DMSO	Sigma-Aldrich, USA	D2650
dNTPs	Promega, USA	U1515
DTT	Invitrogen, USA	R0861
EDTA	Invitrogen, USA	12635
EtBr	Invitrogen, USA	`15585011
Fetal Bovine Serum	Invitrogen, USA	16000044
G418	Invitrogen, USA	11811023
Glutaraldehyde 25%	Sigma-Aldrich, USA	G6257	Infectivity assay
Glycine	Thermo Fisher Scientific, USA	Q24755
HEK-293T	NCCS, India
HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3	NIH, AIDS Repository, USA	114
Inverted microscope	Nikon, Japan	Model: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Biorad, USA	1715124
Jurkat J6	NCCS, India
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich, USA	M8266	Infectivity assay
MMLV-RT	Invitrogen, USA	28025013
MTT reagent	Sigma-Aldrich, USA	M5655	Cell viability assay
N,N-dimethyl formamide	Fluka Chemika	40255	Infectivity assay
NaCl	Thermo Fisher Scientific, USA	Q27605
NaF	Sigma-Aldrich, USA	201154
NP40	Invitrogen, USA	85124
P24 antigen capture ELISA kit	ABL, USA	5421
PageRuler prestained protein ladder	Sci-fi Biologicals, India	PGPMT078
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, USA	P6148
pEGFP-N1	Clontech, USA	632515
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen, USA	151140122
Phosphatase Inhibitor	Sigma-Aldrich, USA	4906837001
Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC buffer	NEB,USA	M05532
pLKO.1-TRC	Addgene, USA	10878	Lentiviral cloning vector
pMD2.G	Addgene, USA	12259	VSV-G envelope vector
PMSF	Sigma-Aldrich, USA	P7626
Polyethylenimine (PEI)	Polysciences, Inc., USA	23966
Potassium ferricyanide	Sigma-Aldrich, USA	244023	Infectivity assay
Potassium ferrocyanide	Sigma-Aldrich, USA	P3289	Infectivity assay
Protease Inhibitor	Sigma-Aldrich, USA	5056489001
psPAX2	Addgene, USA	12260	Lentiviral packaging plasmid
Puromycin	Sigma-Aldrich, USA	P8833	Selection of stable cells
PVDF membrane	Biorad, USA	1620177
Random primers	Invitrogen, USA	48190011
RPMI 1640	Invitrogen, USA	22400105
SDS	Sigma-Aldrich, USA	L3771
Steady-Glo substrate	Promega, USA	E2510	Luciferase assay
T4 DNA ligase	Invitrogen, USA	15224017
TEMED	Invitrogen, USA	17919
Thapsigargin	Sigma-Aldrich, USA	T9033
Thioflavin T	Sigma-Aldrich, USA	596200
Tris	Thermo Fisher Scientific, USA	Q15965
Triton-X-100	Sigma-Aldrich, USA	T8787
Trizol	Invitrogen, USA	15596018
Tween 20	Sigma-Aldrich, USA	P1379
TZM-bl	NIH, AIDS Repository, USA	8129
Ultracentrifuge	Beckman Optima L90K, USA	330049	Rotor-SW28Ti
UltraPure X-gal	Invitrogen, USA	15520-018	Infectivity assay