A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
В данной статье мы описываем некоторые установленные методы определения стресса эндоплазматического ретикулума (ЭР) и активации развернутого белкового ответа (УПО), уделяя особое внимание инфекции ВИЧ-1. В этой статье также описывается набор протоколов для исследования влияния стресса ER/UPR на репликацию ВИЧ-1 и инфекционность вириона.
Вирусные инфекции могут вызывать стресс эндоплазматического ретикулума (ЭР) из-за аномального накопления белка, что приводит к развернутому белковому ответу (UPR). Вирусы разработали стратегии манипулирования UPR хозяина, но в литературе отсутствует подробное понимание модуляции UPR и ее функционального значения во время инфекции ВИЧ-1. В этом контексте в настоящей статье описываются протоколы, используемые в нашей лаборатории для измерения уровней стресса ER и UPR во время инфекции ВИЧ-1 в Т-клетках, а также влияние UPR на репликацию вируса и инфекционность.
Окрашивание тиофлавином Т (ThT) является относительно новым методом, используемым для обнаружения ER-стресса в клетках путем обнаружения белковых агрегатов. Здесь мы проиллюстрировали протокол окрашивания ThT в инфицированных ВИЧ-1 клетках для выявления и количественного определения ER-стресса. Кроме того, стресс ER также был обнаружен косвенно путем измерения уровней маркеров UPR, таких как BiP, фосфорилированный IRE1, PERK и eIF2α, сплайсинга XBP1, расщепления ATF6, ATF4, CHOP и GADD34 в инфицированных клетках ВИЧ-1, с использованием обычного иммуноблоттинга и количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Установлено, что ThT-флуоресценция коррелирует с показателями активации UPR. В данной статье также демонстрируются протоколы анализа влияния стресса ER и модуляции УПО на репликацию ВИЧ-1 с помощью нокдаун-экспериментов, а также использования фармакологических молекул. Влияние УПО на экспрессию/репликацию гена ВИЧ-1 и продукцию вируса анализировали с помощью репортерного анализа люциферазы и ИФА захвата антигена р24 соответственно, тогда как влияние на инфекционность вириона анализировали путем окрашивания инфицированных репортерных клеток. В совокупности этот набор методов обеспечивает всестороннее понимание путей ответа развернутого белка во время инфекции ВИЧ-1, раскрывая его сложную динамику.
Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) характеризуется постепенным снижением количества CD4+ Т-лимфоцитов, что приводит к прогрессирующему провалу иммунного ответа. Вирус иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1) является возбудителем СПИДа. Это оболочечный одноцепочечный РНК-вирус с двумя копиями РНК на вирион, принадлежащий к семейству ретровирид. Производство высоких концентраций вирусных белков в клетке-хозяине создает чрезмерную нагрузку на механизм сворачивания белка в клетке1. ER является первым компартментом в секреторном пути эукариотических клеток. Он отвечает за производство, изменение и дос....
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используются клеточные линии HEK-293T и Jurkat J6 (клеточная линия CD4+T), которые были получены из Cell Repository, NCCS, Пуна, Индия; TZM-bl, клеточная линия, полученная из HeLa, которая интегрировала копии генов β-галактозидазы и люциферазы в промотор24 длинного .......
В данной работе мы описали подробный протокол изучения стресса ER in vitro и активации UPR при инфицировании ВИЧ-1 в Т-клетках (рис. 2). В этом исследовании также описаны методы анализа функциональной значимости УПО в репликации ВИЧ-1 и инфекционности вири.......
Сфера применения настоящего протокола включает в себя: (i) обработку запасов вируса ВИЧ-1 и измерение концентрации вируса и инфекционности вириона, (ii) инфицирование Т-клеток ВИЧ-1 и оценку его влияния на стресс ER и различные маркеры УПО, (iii) влияние нокдауна маркеров УПО.......
Мы благодарим Национальный центр клеточных наук Департамента биотехнологии правительства Индии за внутреннюю поддержку. AT и AD благодарны за поддержку докторских исследований, полученную от Национального центра клеточных наук, Департамента биотехнологии правительства Индии. DM выражает благодарность за Национальную стипендию JC Bose от SERB, правительство Индии.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acrylamamide | Biorad, USA | 1610107 | |
Agarose | G-Biosciences, USA | RC1013 | |
Ammonium persulphate | Sigma-Aldrich, USA | A3678 | |
anti-ATF4 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 11815 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
anti-ATF6 antibody | Abcam, UK | ab122897 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
anti-CHOP antibody | Cell Signaling Technology, USA | 2897 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
anti-eIF2α antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-11386 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
anti-GADD34 antibody | Abcam, UK | ab236516 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-32233 | Western blot detection Dilution-1:3000 |
anti-HSPA5 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 3177 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
anti-IRE1 antibody | Cell Signaling Technology, USA | 3294 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
Anti-mouse HRP conjugate antibody | Biorad, USA | 1706516 | Western blot detection Dilution- 1:4000 |
anti-peIF2α antibody | Invitrogen, USA | 44-728G | Western blot detection Dilution-1:1000 |
anti-PERK antibody | Cell Signaling Technology, USA | 5683 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
anti-pIRE1 antibody | Abcam, UK | ab243665 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
anti-pPERK antibody | Invitrogen, USA | PA5-40294 | Western blot detection Dilution-1:2000 |
Anti-rabbit HRP conjugate antibody | Biorad, USA | 1706515 | Western blot detection Dilution- 1:4000 |
anti-XBP1 antibody | Abcam, UK | ab37152 | Western blot detection Dilution-1:1000 |
Bench top high speed centrifuge | Eppendorf, USA | 5804R | Rotor- F-45-30-11 |
Bench top low speed centrifuge | Eppendorf, USA | 5702R | Rotor- A-4-38 |
Bis-Acrylamide | Biorad, USA | 1610201 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | MP biomedicals, USA | 160069 | |
Bradford reagent | Biorad, USA | 5000006 | |
CalPhos mammalian Transfection kit | Clontech, Takara Bio, USA | 631312 | Virus stock preparation |
CEM-GFP | NIH, AIDS Repository, USA | 3655 | |
Clarity ECL substrate | Biorad, USA | 1705061 | chemiluminescence detecting substrate |
Clarity max ECL substrate | Biorad, USA | 1705062 | chemiluminescence detecting substrate |
Confocal laser scanning microscope | Olympus, Japan | Model:FV3000 | |
Cytospin centrifuge | Thermo Fisher Scientific, USA | ASHA78300003 | |
DMEM | Invitrogen, USA | 11995073 | |
DMSO | Sigma-Aldrich, USA | D2650 | |
dNTPs | Promega, USA | U1515 | |
DTT | Invitrogen, USA | R0861 | |
EDTA | Invitrogen, USA | 12635 | |
EtBr | Invitrogen, USA | `15585011 | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen, USA | 16000044 | |
G418 | Invitrogen, USA | 11811023 | |
Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich, USA | G6257 | Infectivity assay |
Glycine | Thermo Fisher Scientific, USA | Q24755 | |
HEK-293T | NCCS, India | ||
HIV-1 infectious Molecular Clone pNL4-3 | NIH, AIDS Repository, USA | 114 | |
Inverted microscope | Nikon, Japan | Model: Eclipse Ti2 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad, USA | 1715124 | |
Jurkat J6 | NCCS, India | ||
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich, USA | M8266 | Infectivity assay |
MMLV-RT | Invitrogen, USA | 28025013 | |
MTT reagent | Sigma-Aldrich, USA | M5655 | Cell viability assay |
N,N-dimethyl formamide | Fluka Chemika | 40255 | Infectivity assay |
NaCl | Thermo Fisher Scientific, USA | Q27605 | |
NaF | Sigma-Aldrich, USA | 201154 | |
NP40 | Invitrogen, USA | 85124 | |
P24 antigen capture ELISA kit | ABL, USA | 5421 | |
PageRuler prestained protein ladder | Sci-fi Biologicals, India | PGPMT078 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, USA | P6148 | |
pEGFP-N1 | Clontech, USA | 632515 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen, USA | 151140122 | |
Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich, USA | 4906837001 | |
Phusion High-fidelity PCR mastermix with GC buffer | NEB,USA | M05532 | |
pLKO.1-TRC | Addgene, USA | 10878 | Lentiviral cloning vector |
pMD2.G | Addgene, USA | 12259 | VSV-G envelope vector |
PMSF | Sigma-Aldrich, USA | P7626 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences, Inc., USA | 23966 | |
Potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich, USA | 244023 | Infectivity assay |
Potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich, USA | P3289 | Infectivity assay |
Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich, USA | 5056489001 | |
psPAX2 | Addgene, USA | 12260 | Lentiviral packaging plasmid |
Puromycin | Sigma-Aldrich, USA | P8833 | Selection of stable cells |
PVDF membrane | Biorad, USA | 1620177 | |
Random primers | Invitrogen, USA | 48190011 | |
RPMI 1640 | Invitrogen, USA | 22400105 | |
SDS | Sigma-Aldrich, USA | L3771 | |
Steady-Glo substrate | Promega, USA | E2510 | Luciferase assay |
T4 DNA ligase | Invitrogen, USA | 15224017 | |
TEMED | Invitrogen, USA | 17919 | |
Thapsigargin | Sigma-Aldrich, USA | T9033 | |
Thioflavin T | Sigma-Aldrich, USA | 596200 | |
Tris | Thermo Fisher Scientific, USA | Q15965 | |
Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | |
Trizol | Invitrogen, USA | 15596018 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich, USA | P1379 | |
TZM-bl | NIH, AIDS Repository, USA | 8129 | |
Ultracentrifuge | Beckman Optima L90K, USA | 330049 | Rotor-SW28Ti |
UltraPure X-gal | Invitrogen, USA | 15520-018 | Infectivity assay |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved