Medición del estrés del retículo endoplásmico y respuesta proteica desplegada en células T infectadas por VIH-1 y análisis de su papel en la replicación del VIH-1

Las infecciones virales pueden causar estrés en el retículo endoplásmico (RE) debido a la acumulación anormal de proteínas, lo que conduce a la respuesta de proteínas desplegadas (UPR). Los virus han desarrollado estrategias para manipular la UPR del huésped, pero en la literatura hay una falta de comprensión detallada de la modulación de la UPR y su importancia funcional durante la infección por VIH-1. En este contexto, el presente artículo describe los protocolos utilizados en nuestro laboratorio para medir los niveles de estrés del RE y la UPR durante la infección por VIH-1 en células T y el efecto de la UPR sobre la replicación viral y la infectividad.

La tinción con tioflavina T (ThT) es un método relativamente nuevo que se utiliza para detectar el estrés del RE en las células mediante la detección de agregados de proteínas. Aquí, hemos ilustrado el protocolo para la tinción de ThT en células infectadas por VIH-1 para detectar y cuantificar el estrés del RE. Además, el estrés del RE también se detectó indirectamente mediante la medición de los niveles de marcadores UPR como BiP, IRE1, PERK y eIF2α fosforilados, el empalme de XBP1, la escisión de ATF6, ATF4, CHOP y GADD34 en células infectadas por VIH-1, utilizando inmunotransferencia convencional y reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR). Hemos encontrado que la fluorescencia de ThT se correlaciona con los indicadores de activación de UPR. Este artículo también muestra los protocolos para analizar el impacto del estrés del RE y la modulación de UPR en la replicación del VIH-1 mediante experimentos de derribo, así como el uso de moléculas farmacológicas. El efecto de la UPR sobre la expresión/replicación del gen VIH-1 y la producción del virus se analizó mediante ensayos de luciferasa y ELISA de captura de antígeno p24, respectivamente, mientras que el efecto sobre la infectividad del virión se analizó mediante la tinción de células reporteras infectadas. En conjunto, este conjunto de métodos proporciona una comprensión completa de las vías de respuesta de proteínas desplegadas durante la infección por VIH-1, revelando su intrincada dinámica.