Mätning av endoplasmatiskt retikulumstress och utfälld proteinrespons i HIV-1-infekterade T-celler och analys av dess roll i HIV-1-replikation

Virusinfektioner kan orsaka stress i endoplasmatiskt retikulum (ER) på grund av onormal proteinackumulering, vilket leder till oveckad proteinrespons (UPR). Virus har utvecklat strategier för att manipulera värdens UPR, men det saknas en detaljerad förståelse för UPR-modulering och dess funktionella betydelse under HIV-1-infektion i litteraturen. I detta sammanhang beskriver den aktuella artikeln de protokoll som används i vårt laboratorium för att mäta ER-stressnivåer och UPR under HIV-1-infektion i T-celler och effekten av UPR på viral replikation och infektionsförmåga.

Thioflavin T (ThT) färgning är en relativt ny metod som används för att detektera ER-stress i cellerna genom att detektera proteinaggregat. Här har vi illustrerat protokollet för ThT-färgning i HIV-1-infekterade celler för att upptäcka och kvantifiera ER-stress. Dessutom detekterades ER-stress också indirekt genom att mäta nivåerna av UPR-markörer såsom BiP, fosforylerad IRE1, PERK och eIF2α, splitsning av XBP1, klyvning av ATF6, ATF4, CHOP och GADD34 i HIV-1-infekterade celler, med hjälp av konventionell immunoblotting och kvantitativ omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (RT-PCR). Vi har funnit att ThT-fluorescensen korrelerar med indikatorerna för UPR-aktivering. Den här artikeln visar också protokollen för att analysera effekten av ER-stress och UPR-modulering på HIV-1-replikation genom knockdown-experiment samt användningen av farmakologiska molekyler. Effekten av UPR på HIV-1-genuttryck/replikation och virusproduktion analyserades med Luciferase reporter-analyser respektive p24-antigeninfångnings-ELISA, medan effekten på virionens infektivitet analyserades genom infärgning av infekterade reporterceller. Sammantaget ger denna uppsättning metoder en omfattande förståelse för de oveckade proteinresponsvägarna under HIV-1-infektion, vilket avslöjar dess intrikata dynamik.