Producción de lotes de vectores adenoasociados de alto rendimiento utilizando celdas de suspensión HEK293

Los vectores virales adenoasociados (AAV) son una herramienta notable para investigar el sistema nervioso central (SNC). Cápsidas innovadoras, como AAV. PHP.eB, demuestran una transducción extensa del SNC por inyección intravenosa en ratones. Para lograr una transducción comparable, se necesita un título 100 veces mayor (mínimo 1 x 10¹¹ copias del genoma por ratón) en comparación con la inyección directa en el parénquima del SNC. En nuestro grupo, la producción de AAV, incluido el AAV. PHP.eB se basa en células HEK293T adherentes y en el método de triple transfección. Lograr altos rendimientos de AAV con células adherentes implica un proceso intensivo en mano de obra y materiales. Esta limitación impulsó el desarrollo de un protocolo para el cultivo celular en suspensión en tubos cónicos. Los AAV generados en las células adherentes se compararon con el método de producción en suspensión. Se compararon cultivos en suspensión utilizando reactivos de transfección Polietilenimina o TransIt. Los vectores AAV se purificaron mediante ultracentrifugación en gradiente de yodixanol, seguida de intercambio de tampón y concentración mediante un filtro centrífugo. Con el método adherente, logramos un promedio de 2.6 x^{10 12} copias del genoma (GC) en total, mientras que el método de suspensión y la polietilenimina produjeron 7.7 x 10¹² GC en total, y TransIt produjo 2.4 x 10¹³ GC en total. No hay diferencia en la eficiencia de transducción in vivo entre los vectores producidos con adherente en comparación con el sistema de celdas de suspensión. En resumen, se introduce un protocolo de producción de AAV basado en células HEK293 en suspensión, lo que da como resultado una menor cantidad de tiempo y mano de obra necesaria para la producción de vectores, al tiempo que se logran rendimientos de 3 a 9 veces mayores utilizando componentes disponibles de proveedores comerciales con fines de investigación.