ייצור אצוות וקטוריות משויכות אדנו בעלות תפוקה גבוהה באמצעות תאי תרחיף HEK293

Summary

כאן מוצג פרוטוקול ייצור AAV מבוסס תאי HEK293 מתלה, וכתוצאה מכך זמן ועבודה מופחתים הדרושים לייצור וקטורי באמצעות רכיבים הזמינים למטרות מחקר מספקים מסחריים.

Abstract

וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו (AAVs) הם כלי יוצא דופן לחקר מערכת העצבים המרכזית (CNS). קפסידים חדשניים, כגון AAV. PHP.eB, להדגים התמרה נרחבת של CNS על ידי הזרקה תוך ורידי בעכברים. כדי להשיג התמרה דומה, יש צורך בטיטר גבוה פי 100 (מינימום 1 x 10¹¹ עותקי גנום / עכבר) בהשוואה להזרקה ישירה בפרנכימה CNS. בקבוצה שלנו, ייצור AAV, כולל AAV. PHP.eB מסתמך על תאי HEK293T דבקים ועל שיטת הטרנספקציה המשולשת. השגת תפוקות גבוהות של AAV עם תאים דבקים כרוכה בתהליך עתיר עבודה וחומר. אילוץ זה הניע פיתוח פרוטוקול לתרבית תאים מבוססת השעיה בצינורות חרוטיים. AAVs שנוצרו בתאים דבקים הושוו לשיטת ייצור התרחיף. תרבית בהשעיה באמצעות ריאגנטים transfection Polyethylenimine או TransIt הושוו. וקטורי AAV טוהרו על ידי אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול ואחריה חילופי חיץ וריכוז באמצעות מסנן צנטריפוגלי. בשיטה הדבקה השגנו ממוצע של 2.6 x 10¹² עותקי גנום (GC), בעוד ששיטת ההשעיה והפוליאתילנימין הניבו 7.7 x 10¹² GC בסך הכל, ו- TransIt הניב 2.4 x^{10 13} GC בסך הכל. אין הבדל ביעילות התמרת vivo בין וקטורים המיוצרים עם דבק בהשוואה למערכת תאי התלייה. לסיכום, פרוטוקול ייצור AAV מבוסס תאי HEK293 מתרחיף מוצג, וכתוצאה מכך כמות מופחתת של זמן ועבודה הדרושים לייצור וקטורי תוך השגת תפוקות גבוהות פי 3 עד 9 באמצעות רכיבים הזמינים מספקים מסחריים למטרות מחקר.

Introduction

וירוס הקשור לאדנו (AAV) התגלה בשנת 1965 ומאז נעשה בו שימוש במספר עצום של יישומים¹. AAVs יושמו במחקר מדעי המוח כדי לחקור גנים ותפקוד עצבי, למפות מעגלים עצביים, או לייצר מודלים של בעלי חיים למחלות². באופן מסורתי, זה נעשה על ידי הזרקה ישירות באתר של עניין, כמו רוב הסרוטיפים הטבעיים אינם חוצים את מחסום הדם-מוח או צריך מינון גבוה לעשות זאת ^1,2,3.

עם גילוי AAV. PHP.B⁴ וקפסידים מהדור הבא כגון AAV. PHP.eB⁵ ו- AAV. CAP-B10⁶, ניתן לכוון את ....

Protocol

כל הליכי הניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האקדמיה המלכותית ההולנדית למדעים (KNAW) והיו בהתאם לחוק ההולנדי לניסויים בבעלי חיים תחת פרויקט מספר AVD8010020199126. באיור 1 מוצגת סקירה סכמטית של הפרוטוקול המלא. מזריעת תאים ועד לטיהור AAV, הפרוטוקול לוקח 6 ימים .......

Discussion

ניהול מערכתי של AAV הוא כלי רב עוצמה להעברת גנים למערכת העצבים המרכזית; עם זאת, הייצור של AAV הוא תהליך יקר ומייגע. על ידי שימוש בתאי תרחיף, העבודה והפלסטיק מופחתים בהשוואה לתרבית הדבקה של HEK293T על 15 ס"מ² צלחות. יתר על כן, הצינורות החרוטיים המיושמים כאן קלים לטיפול וממקסמים את השימוש בחלל המ.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk	Beckman Coulter	342414
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000,	eppendorf	5920701002
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml	Infors HT/ TPP	587633
Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets	eppendorf	5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes	eppendorf	5948000315
Distilled Water	Gibco	15230147
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DNase I recombinant, RNase-free	Roche	4716728001
DPBS, calcium, magnesium	Gibco	14040091
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2	Fisher	FB12566504
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45	Fisher	FB12566505
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube	Infors HT/ TPP	31362
Holder for 600 ml cell culture tube	Infors HT/ TPP	66129
Incubator Minitron 50 mm	Infors HT	500043
LV-MAX Production Medium	Gibco	A3583401
N-Tray Universal	Infors HT/ TPP	31321
OptiPrep - Iodixanol	Serumwerk bernburg	1893
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Poly-sciences	24765-100
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	72420100
Poly(ethylene glycol) 8000	Sigma-Aldrich	89510
TransIT-VirusGEN	Mirus	Mir 6706
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	5250061
TubeSpin Bioreactors-50ml	TTP	87050
TubeSpin Bioreactors-600ml	TTP	87600
Viral Production Cells	Gibco	A35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000	Cytvia	28932363