Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן מוצג פרוטוקול ייצור AAV מבוסס תאי HEK293 מתלה, וכתוצאה מכך זמן ועבודה מופחתים הדרושים לייצור וקטורי באמצעות רכיבים הזמינים למטרות מחקר מספקים מסחריים.

Abstract

וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו (AAVs) הם כלי יוצא דופן לחקר מערכת העצבים המרכזית (CNS). קפסידים חדשניים, כגון AAV. PHP.eB, להדגים התמרה נרחבת של CNS על ידי הזרקה תוך ורידי בעכברים. כדי להשיג התמרה דומה, יש צורך בטיטר גבוה פי 100 (מינימום 1 x 1011 עותקי גנום / עכבר) בהשוואה להזרקה ישירה בפרנכימה CNS. בקבוצה שלנו, ייצור AAV, כולל AAV. PHP.eB מסתמך על תאי HEK293T דבקים ועל שיטת הטרנספקציה המשולשת. השגת תפוקות גבוהות של AAV עם תאים דבקים כרוכה בתהליך עתיר עבודה וחומר. אילוץ זה הניע פיתוח פרוטוקול לתרבית תאים מבוססת השעיה בצינורות חרוטיים. AAVs שנוצרו בתאים דבקים הושוו לשיטת ייצור התרחיף. תרבית בהשעיה באמצעות ריאגנטים transfection Polyethylenimine או TransIt הושוו. וקטורי AAV טוהרו על ידי אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול ואחריה חילופי חיץ וריכוז באמצעות מסנן צנטריפוגלי. בשיטה הדבקה השגנו ממוצע של 2.6 x 1012 עותקי גנום (GC), בעוד ששיטת ההשעיה והפוליאתילנימין הניבו 7.7 x 1012 GC בסך הכל, ו- TransIt הניב 2.4 x10 13 GC בסך הכל. אין הבדל ביעילות התמרת vivo בין וקטורים המיוצרים עם דבק בהשוואה למערכת תאי התלייה. לסיכום, פרוטוקול ייצור AAV מבוסס תאי HEK293 מתרחיף מוצג, וכתוצאה מכך כמות מופחתת של זמן ועבודה הדרושים לייצור וקטורי תוך השגת תפוקות גבוהות פי 3 עד 9 באמצעות רכיבים הזמינים מספקים מסחריים למטרות מחקר.

Introduction

וירוס הקשור לאדנו (AAV) התגלה בשנת 1965 ומאז נעשה בו שימוש במספר עצום של יישומים1. AAVs יושמו במחקר מדעי המוח כדי לחקור גנים ותפקוד עצבי, למפות מעגלים עצביים, או לייצר מודלים של בעלי חיים למחלות2. באופן מסורתי, זה נעשה על ידי הזרקה ישירות באתר של עניין, כמו רוב הסרוטיפים הטבעיים אינם חוצים את מחסום הדם-מוח או צריך מינון גבוה לעשות זאת 1,2,3.

עם גילוי AAV. PHP.B4 וקפסידים מהדור הבא כגון AAV. PHP.eB5 ו- AAV. CAP-B106, ניתן לכוון את ....

Protocol

כל הליכי הניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האקדמיה המלכותית ההולנדית למדעים (KNAW) והיו בהתאם לחוק ההולנדי לניסויים בבעלי חיים תחת פרויקט מספר AVD8010020199126. באיור 1 מוצגת סקירה סכמטית של הפרוטוקול המלא. מזריעת תאים ועד לטיהור AAV, הפרוטוקול לוקח 6 ימים .......

Representative Results

רוב המעבדות האקדמיות משתמשות בתאי HEK293T דבקים לייצור AAV 8,9. בעוד שזה עובד טוב יחסית כאשר כמויות קטנות של AAV נדרשות להזרקה ישירה, טיטר גבוה פי 100 (מינימום 1 x 1011 GC / עכבר) נדרש כדי להשיג התמרה דומה עם capsids מערכתיים כגון AAV. PHP.eB.

בפרוטוקול זה נקבע י.......

Discussion

ניהול מערכתי של AAV הוא כלי רב עוצמה להעברת גנים למערכת העצבים המרכזית; עם זאת, הייצור של AAV הוא תהליך יקר ומייגע. על ידי שימוש בתאי תרחיף, העבודה והפלסטיק מופחתים בהשוואה לתרבית הדבקה של HEK293T על 15 ס"מ2 צלחות. יתר על כן, הצינורות החרוטיים המיושמים כאן קלים לטיפול וממקסמים את השימוש בחלל המ.......

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מקרן המחקר של האקדמיה המלכותית ההולנדית לאמנויות ולמדעים (KNAW) ומענק מ-Start2Cure (0-TI-01). אנו מודים ללישה קופ על תרומתה ועצותיה בהגדרת הפרוטוקול. הדמויות נוצרו באמצעות Biorender.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50PkBeckman Coulter342414
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000, eppendorf5920701002
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 mlInfors HT/ TPP587633
Aerosol-tight caps, for 750 mL round bucketseppendorf5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubeseppendorf5948000315
Distilled WaterGibco15230147
DNase I recombinant, RNase-freeRoche4716728001
DNase I recombinant, RNase-freeRoche4716728001
DPBS, calcium, magnesiumGibco14040091
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190144
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2FisherFB12566504
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45FisherFB12566505
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tubeInfors HT/ TPP31362
Holder for 600 ml cell culture tubeInfors HT/ TPP66129
Incubator Minitron 50 mmInfors HT500043
LV-MAX Production MediumGibcoA3583401
N-Tray UniversalInfors HT/ TPP31321
OptiPrep - IodixanolSerumwerk bernburg1893
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)Poly-sciences24765-100
Phenol red solution Sigma-Aldrich72420100
Poly(ethylene glycol) 8000Sigma-Aldrich89510
TransIT-VirusGENMirusMir 6706
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco5250061
TubeSpin Bioreactors-50mlTTP87050
TubeSpin Bioreactors-600mlTTP87600
Viral Production CellsGibcoA35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000Cytvia28932363

References

  1. Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).
  2. Pietersz, K. L., et al.

Explore More Articles

206

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved