Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В данной работе представлен протокол производства AAV на основе суспензии HEK293, что приводит к сокращению времени и трудозатрат, необходимых для производства векторов с использованием компонентов, доступных для исследовательских целей у коммерческих поставщиков.

Abstract

Аденоассоциированные вирусные векторы (ААВ) являются замечательным инструментом для исследования центральной нервной системы (ЦНС). Инновационные капсиды, такие как AAV. PHP.eB, демонстрируют обширную трансдукцию ЦНС путем внутривенной инъекции у мышей. Для достижения сопоставимой трансдукции необходим в 100 раз более высокий титр (минимум 1 x 1011 копий генома на мышь) по сравнению с прямой инъекцией в паренхиму ЦНС. В нашей группе производство AAV, в том числе AAV. PHP.eB опирается на адгезивные HEK293T клетки и метод тройной трансфекции. Достижение высоких выходов AAV с адгезивными клетками влечет за собой трудоемкий и материалоемкий процесс. Это ограничение послужило толчком к разработке протокола для суспензионных клеточных культур в конических пробирках. AAV, образующиеся в адгезивных клетках, сравнивали с методом получения суспензии. Сравнивали культуру в суспензии с использованием трансфекционных реагентов Полиэтиленимин или ТрансИт. Векторы AAV очищали с помощью ультрацентрифугирования с градиентом йодиксанола с последующим буферным обменом и концентрированием с использованием центробежного фильтра. С помощью адгезивного метода мы получили в среднем 2,6 x 1012 копий генома (GC), в то время как метод суспензии и полиэтиленимина дал в общей сложности 7,7 x 1012 GC, а TransIt — 2,4 x 1013 GC. Нет различий в эффективности трансдукции in vivo между векторами, полученными с адгезивной системой, по сравнению с системой суспензионных клеток. Таким образом, внедрен протокол производства AAV на основе суспензии HEK293, что приводит к сокращению времени и трудозатрат, необходимых для производства векторов, при достижении в 3-9 раз более высокой производительности при использовании компонентов, доступных у коммерческих поставщиков для исследовательских целей.

Introduction

Аденоассоциированный вирус (AAV) был открыт в 1965 году и с тех пор используется во множествеприложений1. AAV применяются в исследованиях в области неврологии для изучения функций генов и нейронов, картирования нейроцепей или создания животных моделей заболевания2. Традиционно это делается путем инъекции непосредственно в интересующее место, так как большинство естественных серотипов не пересекают гематоэнцефалический барьер и не нуждаются в высокой дозедля этого.

С открытием AAV. PHP.B

Protocol

Все экспериментальные процедуры были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Королевской академии наук Нидерландов (KNAW) и соответствовали голландскому закону об экспериментах на животных в рамках проекта No AVD8010020199126. На рисунке 1 ?.......

Representative Results

Большинство академических лабораторий используют адгезивные HEK293T клетки для производства AAV 8,9. Хотя это работает относительно хорошо, когда для прямой инъекции требуется небольшое количество AAV, для достижения аналогичной трансдукции системными капси?.......

Discussion

Системное введение ААВ является мощным инструментом для переноса генов в ЦНС; однако производство AAV является дорогостоящим и трудоемким процессом. При использовании суспензионных ячеек трудозатраты и пластмассы снижаются по сравнению с адгезивной культурой HEK293T на пластинах 15 см2.......

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантом исследовательского фонда Королевской академии искусств и наук Нидерландов (KNAW) и грантом Start2Cure (0-TI-01). Мы благодарим Лейшу Копп за ее вклад и советы по настройке протокола. Фигуры были созданы с помощью Biorender.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50PkBeckman Coulter342414
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000, eppendorf5920701002
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 mlInfors HT/ TPP587633
Aerosol-tight caps, for 750 mL round bucketseppendorf5820747005
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubeseppendorf5948000315
Distilled WaterGibco15230147
DNase I recombinant, RNase-freeRoche4716728001
DNase I recombinant, RNase-freeRoche4716728001
DPBS, calcium, magnesiumGibco14040091
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190144
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2FisherFB12566504
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45FisherFB12566505
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tubeInfors HT/ TPP31362
Holder for 600 ml cell culture tubeInfors HT/ TPP66129
Incubator Minitron 50 mmInfors HT500043
LV-MAX Production MediumGibcoA3583401
N-Tray UniversalInfors HT/ TPP31321
OptiPrep - IodixanolSerumwerk bernburg1893
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)Poly-sciences24765-100
Phenol red solution Sigma-Aldrich72420100
Poly(ethylene glycol) 8000Sigma-Aldrich89510
TransIT-VirusGENMirusMir 6706
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco5250061
TubeSpin Bioreactors-50mlTTP87050
TubeSpin Bioreactors-600mlTTP87600
Viral Production CellsGibcoA35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000Cytvia28932363

References

  1. Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).
  2. Pietersz, K. L., et al.

Explore More Articles

206

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved