A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
В данной работе представлен протокол производства AAV на основе суспензии HEK293, что приводит к сокращению времени и трудозатрат, необходимых для производства векторов с использованием компонентов, доступных для исследовательских целей у коммерческих поставщиков.
Аденоассоциированные вирусные векторы (ААВ) являются замечательным инструментом для исследования центральной нервной системы (ЦНС). Инновационные капсиды, такие как AAV. PHP.eB, демонстрируют обширную трансдукцию ЦНС путем внутривенной инъекции у мышей. Для достижения сопоставимой трансдукции необходим в 100 раз более высокий титр (минимум 1 x 1011 копий генома на мышь) по сравнению с прямой инъекцией в паренхиму ЦНС. В нашей группе производство AAV, в том числе AAV. PHP.eB опирается на адгезивные HEK293T клетки и метод тройной трансфекции. Достижение высоких выходов AAV с адгезивными клетками влечет за собой трудоемкий и материалоемкий процесс. Это ограничение послужило толчком к разработке протокола для суспензионных клеточных культур в конических пробирках. AAV, образующиеся в адгезивных клетках, сравнивали с методом получения суспензии. Сравнивали культуру в суспензии с использованием трансфекционных реагентов Полиэтиленимин или ТрансИт. Векторы AAV очищали с помощью ультрацентрифугирования с градиентом йодиксанола с последующим буферным обменом и концентрированием с использованием центробежного фильтра. С помощью адгезивного метода мы получили в среднем 2,6 x 1012 копий генома (GC), в то время как метод суспензии и полиэтиленимина дал в общей сложности 7,7 x 1012 GC, а TransIt — 2,4 x 1013 GC. Нет различий в эффективности трансдукции in vivo между векторами, полученными с адгезивной системой, по сравнению с системой суспензионных клеток. Таким образом, внедрен протокол производства AAV на основе суспензии HEK293, что приводит к сокращению времени и трудозатрат, необходимых для производства векторов, при достижении в 3-9 раз более высокой производительности при использовании компонентов, доступных у коммерческих поставщиков для исследовательских целей.
Аденоассоциированный вирус (AAV) был открыт в 1965 году и с тех пор используется во множествеприложений1. AAV применяются в исследованиях в области неврологии для изучения функций генов и нейронов, картирования нейроцепей или создания животных моделей заболевания2. Традиционно это делается путем инъекции непосредственно в интересующее место, так как большинство естественных серотипов не пересекают гематоэнцефалический барьер и не нуждаются в высокой дозедля этого.
С открытием AAV. PHP.B
Все экспериментальные процедуры были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Королевской академии наук Нидерландов (KNAW) и соответствовали голландскому закону об экспериментах на животных в рамках проекта No AVD8010020199126. На рисунке 1 ?.......
Большинство академических лабораторий используют адгезивные HEK293T клетки для производства AAV 8,9. Хотя это работает относительно хорошо, когда для прямой инъекции требуется небольшое количество AAV, для достижения аналогичной трансдукции системными капси?.......
Системное введение ААВ является мощным инструментом для переноса генов в ЦНС; однако производство AAV является дорогостоящим и трудоемким процессом. При использовании суспензионных ячеек трудозатраты и пластмассы снижаются по сравнению с адгезивной культурой HEK293T на пластинах 15 см2.......
Эта работа была поддержана грантом исследовательского фонда Королевской академии искусств и наук Нидерландов (KNAW) и грантом Start2Cure (0-TI-01). Мы благодарим Лейшу Копп за ее вклад и советы по настройке протокола. Фигуры были созданы с помощью Biorender.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm - 50Pk | Beckman Coulter | 342414 | |
Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4x1000, | eppendorf | 5920701002 | |
Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets | eppendorf | 5820747005 | |
Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes | eppendorf | 5948000315 | |
Distilled Water | Gibco | 15230147 | |
DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040091 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2 | Fisher | FB12566504 | |
Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube | Infors HT/ TPP | 31362 | |
Holder for 600 ml cell culture tube | Infors HT/ TPP | 66129 | |
Incubator Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
LV-MAX Production Medium | Gibco | A3583401 | |
N-Tray Universal | Infors HT/ TPP | 31321 | |
OptiPrep - Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
Phenol red solution | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
Poly(ethylene glycol) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 5250061 | |
TubeSpin Bioreactors-50ml | TTP | 87050 | |
TubeSpin Bioreactors-600ml | TTP | 87600 | |
Viral Production Cells | Gibco | A35347 | |
Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved