Demonstramos um método que aproveita a microscopia confocal de varredura rápida para realizar imagens ao vivo de células da microglia no tectum óptico do peixe-zebra em desenvolvimento, permitindo a análise da dinâmica dessas células in vivo.
A microglia é uma célula altamente dinâmica e sua migração e colonização do parênquima cerebral é uma etapa crucial para o desenvolvimento e função adequados do cérebro. Os embriões de peixe-zebra em desenvolvimento externo possuem transparência óptica, que, juntamente com linhas repórter transgênicas bem caracterizadas que rotulam fluorescentemente a microglia, tornam o peixe-zebra um modelo de vertebrado ideal para tais estudos. Neste artigo, aproveitamos as características únicas do modelo de peixe-zebra para visualizar a dinâmica das células da microglia in vivo e sob condições fisiológicas. Usamos microscopia confocal para registrar um lapso de tempo de células da microglia no tectum óptico do embrião de peixe-zebra e, em seguida, extraímos dados de rastreamento usando o software IMARIS 10.0 para obter o caminho de migração das células, velocidade média e distribuição no tectum óptico em diferentes estágios de desenvolvimento. Este protocolo pode ser uma ferramenta útil para elucidar o significado fisiológico do comportamento da microglia em vários contextos, contribuindo para uma caracterização mais profunda dessas células altamente móveis.
Como macrófagos residentes no sistema nervoso central (SNC), a microglia representa uma população não neuronal distinta que representa até 15% de todas as células gliais no cérebro adulto. O estudo da biologia da microglia tem ganhado cada vez mais atenção nos últimos anos devido à sua importância estabelecida no desenvolvimento, fisiologia e doença1. Em condições fisiológicas, as células microgliais são altamente dinâmicas, examinando continuamente o parênquima cerebral 2,3. Esse comportamento permite que a micróglia colonize o cérebro e desempenhe papéis fundamentais em seu desenvolvimento, como moldar os circuitos neuronais4, a poda sináptica5 e a vasculogênese6. Além disso, essa natureza dinâmica inerente permite que a microglia monitore constantemente o SNC em busca de sinais de infecção, lesão ou quaisquer desvios da homeostase7. Para dissecar essas intrincadas dinâmicas celulares, imagens ao vivo da microglia no espaço e no tempo são indispensáveis. Felizmente, a transparência óptica de embriões de peixe-zebra em desenvolvimento externo, juntamente com a disponibilidade de linhas repórter transgênicas bem caracterizadas que marcam fluorescentemente a microglia, posiciona o peixe-zebra como um modelo de vertebrado ideal para tais investigações. A imagem ao vivo em embriões de peixe-zebra oferece uma abordagem não invasiva que não requer cirurgia ou manipulação extensa de tecidos, minimizando possíveis perturbações no estado do SNC. Esta é uma consideração crítica ao estudar células microgliais, pois elas são altamente sensíveis até mesmo a mudanças sutis no ambiente extracelular8.
Aqui, fornecemos uma diretriz para rastrear com sucesso os movimentos das células microgliais 3D no embrião de peixe-zebra, permitindo uma visão sem precedentes do comportamento da microglia dentro da arquitetura intacta do parênquima cerebral em desenvolvimento (consulte a Figura 1 para obter uma visão geral gráfica do protocolo). Este protocolo passo a passo detalha como configurar e obter imagens da micróglia do peixe-zebra em diferentes estágios de desenvolvimento e como extrair dados de alta resolução sobre a motilidade das células da microglia para fornecer informações valiosas sobre seus padrões migratórios e respostas a pistas ambientais. Também demonstramos que este protocolo pode ser adaptado para realizar imagens multicoloridas ao vivo, estendendo assim sua aplicabilidade ao estudo da microglia em combinação com linhas transgênicas que marcam células vizinhas, incluindo neurônios3, oligodendrócitos9 e células endoteliais10 (como mostrado na Figura 2). Ao adicionar à caixa de ferramentas que permite observar e caracterizar diretamente a dinâmica do comportamento da microglia em tempo real e em seu ambiente natural, este protocolo provavelmente contribuirá para elucidar melhor a funcionalidade da microglia durante o desenvolvimento inicial, tanto na fisiologia quanto na doença.
Os peixes-zebra foram mantidos em condições padrão, de acordo com FELASA42 e institucionais (Université Libre de Bruxelles, Bruxelas, Bélgica; ULB). Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética para o Bem-Estar Animal da ULB (CEBEA) da ULB.
1. Criação de peixe-zebra e preparação de embriões
NOTA: A linhagem transgênica de peixe-zebra Tg(mpeg1:eGFP)gl22 que expressa a proteína fluorescente eGFP em macrófagos, incluindo microglia, foi usada para gerar os dados de rastreamento mostrados neste protocolo. Outras linhagens repórteres de macrófagos estão disponíveis no ZIRC e também podem ser usadas. Na escolha da linhagem transgênica, é importante considerar que uma alta intensidade de sinal facilitará a aquisição de imagens e a segmentação celular.
2. Montagem de peixe-zebra
3. Análise de rastreamento e exportação de dados
Células microgliais que expressam proteína fluorescente verde (eGFP) e células endoteliais que expressam DsRed em Tg(mpeg1:eGFPgl22; KDRL: CRES898; actb2:loxP-STOP-loxP-DsRedexpress,sd5) embriões transgênicos triplos14 foram fotografados a 3 dpf, de acordo com o protocolo descrito. Um único embrião de peixe-zebra foi montado em agarose de baixo ponto de fusão a 1% em uma placa de vidro inferior e o processo de imagem não impediu o crescimento do embrião durante o tempo de aquisição. O timelapse foi registrado usando um sistema comercial de microscopia confocal de varredura pontual equipado com uma lente objetiva seca de 10x 0,45 NA, e lasers de excitação de 488 nm e 561 nm foram usados para imagens de células microgliais e endoteliais, respectivamente. Além disso, o intervalo de tempo, a resolução da imagem, o tamanho do pixel e o passo z foram de 30 segundos (s), 1024x1024, 0,49 μm e 2,5 μm, respectivamente. O registro em timelapse teve duração de 3,5 horas (h).
O campo de visão adquirido cobria toda a cabeça do embrião, mas a análise se concentrou especificamente no tecto óptico, pois durante a primeira semana de desenvolvimento, as microglias ficam restritas principalmente à camada de soma neuronal dessa região do mesencéfalo dorsal, permitindo que os pesquisadores visualizem toda a população simultaneamente15. A análise de rastreamento 3D foi realizada usando o Imaris 10.0, conforme explicado acima. Conforme mostrado na Figura 4, o rastreamento foi bem-sucedido, resultando em 25 trilhas, correspondendo ao número esperado de células da microglia presentes no tectum óptico em 3 dpf16. Uma correção manual mínima dos rastros foi necessária. A Figura 5 mostra um exemplo dos dados que é possível extrair de um experimento de rastreamento bem-sucedido. A marcação simultânea de macrófagos e células endoteliais permite a quantificação da posição da microglia em relação a estas últimas, permitindo que os pesquisadores visualizem a distância relativa de cada célula até a célula endotelial mais próxima no tempo e examinem a frequência e o número de interações potenciais (Figura 5).
Figura 1: Visão geral do procedimento experimental. (A) Preparação e anestesia de embriões de peixe-zebra. (B) Montagem e posicionamento da amostra. (C) Aquisição de imagens. (D) Processamento de imagem e extração de dados de motilidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem da microglia e interações com o ambiente celular do cérebro no embrião de peixe-zebra. (A) Imagem de campo claro de uma cabeça e cérebro embrionários de peixe-zebra de 3 dpf (vista dorsal), rotulando o tectum óptico e o rombencéfalo. O cérebro do peixe-zebra embrionário pode ser fotografado em sua totalidade nesta fase devido ao seu pequeno tamanho e transparência óptica. (BD) A localização e o comportamento da microglia podem ser visualizados pelo uso de linhagens transgênicas como (B,C) Tg(mpeg1:eGFP)gl22 e (D) Tg(mpeg1:mcherry)gl23, e com foco no OT. (B) Os neurônios e seus corpos celulares podem ser identificados usando a linha repórter Tg (XlTubb :D sRed) zf148 e as interações microglia-neurônio podem ser visualizadas pela fusão dos dois canais em linhas que co-expressam ambos os transgenes. Visto é uma fusão dos sinais verde (microglia) e vermelho (neurônios, em magenta). (C, D) As linhas repórter também podem lançar luz sobre as interações da microglia (em verde) com células endoteliais, aqui marcadas em vermelho usando o (C) duplo Tg (kdrl: cres898; actb2:LOXP-STOP-LOXP-Dsredexpress, sd5) transgênicos, ou com células gliais como oligodendrócitos e seus precursores, usando o (D) duplo Tg(olig2:EGFP; MPEG1:mCherry ) linha transgênica. 1: oligodendrócitos e células progenitoras no OT, 2: neurônios eurydendroides no cerebelo. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: dpf = dias pós-fertilização; OT = tectum óptico; HB = rombencéfalo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Disparidade morfológica e espacial entre macrófagos da pele e micróglia em um embrião de peixe-zebra de 3 dpf. (A, B) Vista dorsal de um embrião de peixe-zebra Tg (mpeg1: eGFP) gl22 a 3 dpf, representando (A) células da microglia parenquimatosa (marcadas por asteriscos magenta) versus macrófagos da pele (asteriscos brancos), identificados com base em sua posição relativa ao longo do eixo z, como visto em (B), que mostra a imagem 3D monocromática renderizada com codificação de cores do eixo z. (C, D) Vista lateral de (C) A e (D) B, mostrando as profundidades z das células mpeg1: eGFP + dentro da cabeça do embrião e destacando a localização superficial dos macrófagos da pele em comparação com as células microgliais. (E-K) Alta ampliação de cada célula indicada por um asterisco em A e B, fornecendo uma visualização detalhada das morfologias distintas entre a micróglia amebóide (EG) e os macrófagos cutâneos alongados (HK). Barras de escala = 30 μm. Abreviatura: dpf = dias após a fertilização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Rastreamento de células microgliais em um embrião de peixe-zebra de 3 dpf. (A) Vista dorsal da cabeça de um Tg de 3 dpf (kdrl: cres898; actb2: LOXP-STOP-LOXP-Dsredexpresso, sd5; mpeg1:eGFPgl22) embrião triplo transgênico, mostrando microglia (verde) e a renderização da superfície dos vasos (magenta). (BD) Rastreamento representativo dos movimentos da microglia em uma janela de tempo (B) de 3,5 h. As células individuais são vistas seguindo trajetórias complexas. (C) Detalhe do timelapse, mostrando uma visão ampliada da região em B delimitada pelo quadrado tracejado. Seis quadros do filme (45 minutos de intervalo) são apresentados, documentando a micróglia estabelecendo contatos transitórios com células endoteliais em seu microambiente. (D) Trajetórias de migração de células microgliais individuais dentro do tectum óptico, com os eixos X, Y e Z representando dimensões espaciais. Barra de escala = 50 μm. Abreviatura: dpf = dias após a fertilização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Visualização dos dados obtidos. Exemplo dos dados espaciais que podem ser obtidos usando o protocolo descrito. Os gráficos mostram (A) a velocidade média das células microgliais, (B) a distância média que percorrem em 1 h, (C) seu deslocamento quadrático médio e (D) sua distribuição no espaço em diferentes momentos. A renderização da superfície do vaso também permitiu a medição da distância mais curta entre a microglia e as células endoteliais em um determinado momento, tanto no nível (E) de célula única quanto na média global (F). Para A, B e D, cada ponto representa uma célula individual. N = um embrião. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo Suplementar 1: Clique aqui para baixar este Arquivo.
O protocolo atual permite imagens in vivo da dinâmica da microglia em um embrião de vertebrado e visualização dos dados de motilidade adquiridos. A colonização da micróglia do cérebro em desenvolvimento ocorre muito cedo durante a embriogênese e precede eventos críticos, como picos de neurogênese, astrogliogênese, oligodendrogênese e muitos outros processos celulares17. Portanto, não é surpreendente que a microglia desempenhe funções importantes na formação de aspectos específicos do desenvolvimento do cérebro18, por exemplo, por meio da regulação da diferenciação, migração e sobrevivência neuronal19 , 20 , 21 , bem como poda sináptica5 e mielinização22 , 23 , 24 .
A contribuição da microglia disfuncional para a patogênese e/ou progressão dos distúrbios do neurodesenvolvimento também está sendo cada vez mais reconhecida25. De fato, a presença precoce de microglia no cérebro em formação expõe essas células a estados fisiológicos distintos26 e mudanças ambientais. Isso pode ter um impacto significativo, uma vez que a microglia são células de vida longa em roedores e humanos, sendo mantidas durante a vida útil por meio da auto-renovação de progenitores locais 27,28,29. Acreditamos que este protocolo pode servir como uma ferramenta poderosa para caracterizar melhor o comportamento da microglia nesses estados fisiológicos distintos, à medida que se desenvolvem, amadurecem e estabelecem sua rede durante as etapas sucessivas da morfogênese cerebral.
Usando a configuração descrita aqui, temos imagens e adquirimos com sucesso dados sobre larvas de peixe-zebra com até 6 dpf. Estender a análise para estágios posteriores de desenvolvimento provavelmente será bem-sucedido, mas exigirá o ajuste da configuração da imagem para levar em consideração o aumento do tamanho da amostra, especialmente ao longo do eixo z. Ao tentar isso, sugerimos focar na manutenção de uma baixa relação sinal-ruído e tempo de varredura rápido, pois são parâmetros-chave para uma análise bem-sucedida.
Sugerimos um tempo mínimo de imagem de 1 h para permitir o rastreamento da microglia; A janela de imagem mais longa que foi testada com este protocolo é de 8 h. Além disso, é importante que a análise de rastreamento mantenha o intervalo de tempo entre os quadros o mais curto possível, idealmente entre 30 s e 60 s. Isso permitirá dados de rastreamento mais precisos e detalhados em análises posteriores. Portanto, especialmente se detectar mais de um fluoróforo, é fundamental evitar a sobreposição espectral e garantir separação suficiente entre os dois espectros de emissão de fluoróforos para permitir uma aquisição simultânea, sem sangramento de sinal.
Outros protocolos para gravação de lapso de tempo de alta qualidade do cérebro do peixe-zebra estão disponíveis30, mas este é o primeiro que mostra como rastrear com sucesso todo o movimento da microglia durante o desenvolvimento embrionário por um período prolongado. Embora o fluxo de trabalho apresentado aqui tenha se concentrado no rastreamento da microglia em um contexto fisiológico, ele pode ser facilmente aplicado à análise da microglia em patologia. De fato, vários modelos de distúrbios do neurodesenvolvimento, como autismo31, epilepsia32 e esquizofrenia33, mas também neurodegeneração34 e câncer35, foram estabelecidos em peixes-zebra que fornecem oportunidades únicas para determinar a resposta e o comportamento microglial em condições de doença.
Notavelmente, este protocolo de rastreamento é altamente versátil e também pode ser fundamental para lançar luz sobre os padrões de migração de vários tipos de células em diversas regiões anatômicas do embrião de peixe-zebra, abrindo assim potencialmente caminhos para aplicações adicionais, além do escopo de investigação microglial descrito neste artigo. Além disso, ao aproveitar a capacidade de combinar várias linhas transgênicas fluorescentes, ganhamos a capacidade de discernir a relação espacial entre a microglia e outros tipos de células do microambiente cerebral, com o potencial de visualizar interações celulares e conversas cruzadas ao longo de gravações de lapso de tempo, de forma não invasiva. Isso pode ser fundamental para desvendar o significado fisiológico do comportamento da microglia e contribuir para uma caracterização mais profunda dessas células altamente móveis.
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Os autores gostariam de expressar sua sincera gratidão ao professor Nicolas Bayens por generosamente fornecer acesso ao microscópio confocal essencial para este estudo. Este trabalho foi financiado em parte pelos Fundos para Pesquisa Científica (FNRS) sob os números de concessão F451218F e UG03019F, a Alzheimer Research Foundation (SAO-FRA) (para VW), AM é apoiado por uma bolsa de pesquisa do FNRS. A Figura 1 foi criada em biorender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 L Breeding tanks | Tecniplast | ZB10BTE | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
Bottom glass imaging dish | FluoroDish | FD3510-100 | |
Disposable Graduated transfer pipette | avantor | 16001-188 | |
Dry block heater | Novolab | Grant QBD4 | To keep low melting agarose at 37 °C |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Imaris 10.0 | Oxford Instruments | analysis software | |
Imaris File Converter | Oxford Instruments | https://imaris.oxinst.com/big-data | |
Laser-scanning confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti2-E | |
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50081 | |
Petri dishes (90 mm) | avantor | 391-0559 | |
Pronase | Sigma-Aldrich | 11459643001 | |
Stainless Steel Forceps Dumont No. 5 | FineScienceTools | 11254-20 | |
Stereo microscope | Leica | Leica M80 | To mount the embryos |
teasing needle | avantor | 76549-024 |
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