Мы демонстрируем метод, который использует преимущества быстрой сканирующей конфокальной микроскопии для выполнения визуализации клеток микроглии в развивающемся тектуме зрительного нерва рыбки данио, что позволяет анализировать динамику этих клеток in vivo.
Микроглия является высокодинамичной клеткой, и ее миграция и колонизация паренхимы мозга является важным этапом для правильного развития и функционирования мозга. Внешне развивающиеся эмбрионы данио-рерио обладают оптической прозрачностью, что наряду с хорошо охарактеризованными трансгенными репортерными линиями, флуоресцентно помечающими микроглию, делает данио-рерио идеальной моделью позвоночных для таких исследований. В этой статье мы используем уникальные особенности модели рыбок данио-рерио для визуализации динамики клеток микроглии in vivo и в физиологических условиях. С помощью конфокальной микроскопии мы регистрируем таймлапс клеток микроглии в тектуме зрительного нерва эмбриона рыбки данио, а затем извлекаем данные слежения с помощью программного обеспечения IMARIS 10.0 для получения информации о пути миграции клеток, средней скорости и распределении в тектуме зрительного нерва на разных стадиях развития. Этот протокол может быть полезным инструментом для выяснения физиологического значения поведения микроглии в различных контекстах, способствуя более глубокой характеристике этих высокоподвижных клеток.
Будучи резидентными макрофагами в центральной нервной системе (ЦНС), микроглии представляют собой отдельную ненейрональную популяцию, на долю которой приходится до 15% всех глиальных клеток мозга взрослого человека. Изучение биологии микроглии привлекает все большее внимание в последние годы в связи с ее установленной важностью в развитии, физиологии и болезнях1. В физиологических условиях клетки микроглии обладают высокой динамикой, непрерывно исследуя паренхиму мозга 2,3. Такое поведение позволяет микроглии колонизировать мозг и играть ключевую роль в его развитии, например, в формировании нейронных цепей4, синаптической обрезке5 и васкулогенезе. Кроме того, эта присущая ей динамическая природа позволяет микроглии постоянно контролировать ЦНС на предмет признаков инфекции, травмы или любых отклонений от гомеостаза. Чтобы проанализировать эту сложную клеточную динамику, необходимо получить живую визуализацию микроглии в пространстве и времени. К счастью, оптическая прозрачность внешне развивающихся эмбрионов данио-рерио в сочетании с наличием хорошо охарактеризованных трансгенных репортерных линий, которые флуоресцентно помечают микроглию, позиционируют рыбок данио как идеальную модель позвоночных для таких исследований. Живая визуализация эмбрионов рыбок данио предлагает неинвазивный подход, который не требует хирургического вмешательства или обширных манипуляций с тканями, сводя к минимуму потенциальные нарушения состояния ЦНС. Это критически важный фактор при изучении микроглиальных клеток, поскольку они очень чувствительны даже к незначительным изменениям во внеклеточной среде8.
В этой статье мы предоставляем рекомендации по успешному отслеживанию движений 3D-клеток микроглии в эмбрионе рыбки данио, что позволяет получить беспрецедентное представление о поведении микроглии в неповрежденной архитектуре развивающейся паренхимы мозга (графический обзор протокола см. на рисунке 1). В этом пошаговом протоколе подробно описано, как настроить и визуализировать микроглию рыбок данио на разных стадиях развития, а также как извлечь данные с высоким разрешением о подвижности клеток микроглии, чтобы получить ценную информацию об их миграционных моделях и реакциях на сигналы окружающей среды. Мы также демонстрируем, что этот протокол может быть адаптирован для выполнения многоцветной визуализации в реальном времени, тем самым расширяя его применимость для изучения микроглии в сочетании с трансгенными линиями, которые маркируют соседние клетки, включая нейроны3, олигодендроциты9 и эндотелиальные клетки10 (как показано на рисунке 2). Добавляя к набору инструментов, который позволяет напрямую наблюдать и характеризовать динамику поведения микроглии в режиме реального времени и в ее естественной среде, этот протокол, вероятно, будет способствовать лучшему выяснению функциональности микроглии на ранних стадиях, как в физиологии, так и в болезнях.
Рыбки данио-рерио содержались в стандартных условиях, согласно FELASA42 и институциональным (Свободный университет Брюсселя, Брюссель, Бельгия; ULB) руководящие принципы и правила. Все экспериментальные процедуры были одобрены Этическим комитетом по благополучию животных ULB (CEBEA) от ULB.
1. Разведение рыбок данио и подготовка эмбрионов
ПРИМЕЧАНИЕ: Трансгенная линия рыбок данио Tg(mpeg1:eGFP)gl22 , которая экспрессирует флуоресцентный белок eGFP в макрофагах, включая микроглию, была использована для получения данных слежения, показанных в этом протоколе. Другие репортерные линии макрофагов доступны в ZIRC и также могут быть использованы. При выборе трансгенной линии важно учитывать, что высокая интенсивность сигнала будет способствовать получению изображений и сегментации клеток.
2. Крепление данио-рерио
3. Отслеживание, анализ и экспорт данных
Микроглиальные клетки, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (eGFP), и эндотелиальные клетки, экспрессирующие DsRed в Tg(mpeg1:eGFPgl22; KDRL:CRES898; actb2:loxP-STOP-loxP-DsRedexpress,sd5) тройные трансгенные эмбрионы14 были визуализированы с частотой 3 dpf, в соответствии с описанным протоколом. Один эмбрион рыбки данио был помещен в агарозу с низкой температурой 1% на нижнюю стеклянную пластину, и процесс визуализации не препятствовал росту эмбриона во время приобретения. Таймлапс был зарегистрирован с помощью коммерческой системы точечной сканирующей конфокальной микроскопии, оснащенной 10-кратной линзой сухого объектива 0,45 НК, а для визуализации микроглии и эндотелиальных клеток использовались возбуждающие лазеры с длиной волны 488 нм и 561 нм соответственно. Кроме того, временной интервал, разрешение изображения, размер пикселя и шаг z составили 30 секунд (с), 1024x1024, 0,49 мкм и 2,5 мкм соответственно. Покадровая съемка длилась 3,5 часа (ч).
Приобретенное поле зрения охватывало всю голову эмбриона, но анализ был сосредоточен именно на тектуме зрительного нерва, так как в течение первой недели развития микроглия в основном ограничена нейрональным слоем сомы этой области дорсального среднего мозга, что позволило исследователям визуализировать всю популяциюодновременно. Анализ 3D-трекинга был выполнен с использованием Imaris 10.0, как описано выше. Как показано на рисунке 4, отслеживание было успешным, в результате чего было получено 25 треков, что соответствует ожидаемому количеству клеток микроглии, присутствующих в тектуме зрительного нерва при 3 dpf16. Требовалась минимальная ручная коррекция треков. На рисунке 5 показан пример данных, которые можно извлечь из успешного эксперимента по отслеживанию. Одновременное мечение макрофагов и эндотелиальных клеток позволяет количественно оценить положение микроглии относительно последних, что позволяет исследователям визуализировать относительное расстояние каждой клетки до ближайшей эндотелиальной клетки во времени и изучить частоту и количество потенциальных взаимодействий (рис. 5).
Рисунок 1: Обзор экспериментальной процедуры. (A) Подготовка эмбрионов рыбок данио-рерио и анестезия. (B) Монтаж и позиционирование образца. (C) Получение изображений. (D) Обработка изображений и извлечение данных о подвижности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Визуализация микроглии и взаимодействие с клеточной средой мозга у эмбриона рыбки данио. (A) Светлопольное изображение головы и мозга эмбриона данио-рерио размером 3 dpf (дорсальный вид), обозначающее тектум зрительного нерва и задний мозг. Мозг эмбриональной рыбки данио может быть полностью визуализирован на этом этапе благодаря его небольшому размеру и оптической прозрачности. (Б-Г) Расположение и поведение микроглии можно визуализировать с помощью трансгенных линий, таких как (B,C) Tg(mpeg1:eGFP)gl22 и (D) Tg(mpeg1:mcherry)gl23, и сосредоточившись на OT. (B) Нейроны и их клеточные тела могут быть идентифицированы с помощью репортерной линии Tg(XlTubb:D sRed)zf148 , а взаимодействия микроглии и нейронов могут быть визуализированы путем слияния двух каналов в линии, которые совместно экспрессируют оба трансгена. Видимым является слияние зеленого (микроглия) и красного (нейроны, пурпурный) сигналов. (К,Г) Репортерные линии также могут пролить свет на взаимодействие микроглии (зеленым) с эндотелиальными клетками, здесь помеченные красным цветом с помощью (C) двойного Tg(kdrl:cres898; actb2:LOXP-STOP-LOXP-Dsredexpress, sd5) или с глиальными клетками, такими как олигодендроциты и их предшественники, с использованием (D) двойного Tg(olig2:EGFP; mpeg1:mcherry ) трансгенная линия. 1: олигодендроциты и клетки-предшественники в ОТ, 2: эвридендроидные нейроны в мозжечке. Масштабные линейки = 50 μм. Сокращения: dpf = дни после оплодотворения; OT = оптический тектум; HB = задний мозг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Морфологическое и пространственное несоответствие между макрофагами кожи и микроглией у эмбриона данио-рерио размером 3 dpf. (A,B) Дорсальный вид эмбриона Tg(mpeg1:eGFP)gl22 при 3 dpf, изображающий (A) клетки паренхиматозной микроглии (отмеченные пурпурными звездочками) и кожные макрофаги (белые звездочки), идентифицированные на основе их взаимного расположения вдоль оси z, как видно на рисунке (B), в котором отображается монохромное 3D-изображение, визуализированное с помощью цветового кодирования по оси Z. (К,Г) Вид сбоку (C) A и (D) B, демонстрирующий z-глубины клеток mpeg1:eGFP+ в голове эмбриона и подчеркивающий поверхностную локализацию макрофагов кожи по сравнению с микроглиальными клетками. (Э-К) Высокое увеличение каждой клетки, обозначенное звездочкой в точках А и В, обеспечивает детальную визуализацию различных морфологий между амебоидной микроглией (E-G) и макрофагами удлиненной кожи (H-K). Масштабные линейки = 30 μм. Сокращение: dpf = дни после оплодотворения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: Отслеживание клеток микроглии в эмбрионе данио-рерио размером 3 dpf. (A) Дорсальный вид головы 3 dpf Tg(kdrl:cres898; actb2:LOXP-STOP-LOXP-Dsredexpress,sd5; mpeg1:eGFPgl22) тройной трансгенный эмбрион, показывающий микроглию (зеленый) и поверхностную визуализацию сосудов (пурпурный). (Б-Г) Репрезентативное отслеживание движений микроглии в течение (B) 3,5 часового временного окна. Видно, что отдельные клетки следуют сложным траекториям. (C) Деталь из таймлапса, показывающая увеличенное изображение области в B , заключенной в пунктирный квадрат. Представлены шесть кадров из фильма (с интервалом в 45 минут), документирующих микроглию, устанавливающую транзиторные контакты с эндотелиальными клетками в их микроокружении. (D) Траектории миграции отдельных микроглиальных клеток в пределах оптического тектума, где оси X, Y и Z представляют пространственные размеры. Масштабная линейка = 50 мкм. Сокращение: dpf = дни после оплодотворения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5: Визуализация полученных данных. Пример пространственных данных, которые могут быть получены с помощью описанного протокола. Графики отображают (А) среднюю скорость микроглиальных клеток, (В) среднее расстояние, которое они преодолевают за 1 ч, (В) их среднее квадратное смещение и (Г) их распределение в пространстве в разное время. Визуализация поверхности сосуда также позволила измерить кратчайшее расстояние между микроглией и эндотелиальными клетками в любой момент времени, как на уровне (E) одиночных клеток, так и в среднем по миру (F). Для A, B и D каждая точка представляет отдельную клетку. N = один эмбрион. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Дополнительный файл 1: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Текущий протокол позволяет in vivo визуализировать динамику микроглии у эмбриона позвоночного и визуализировать полученные данные о подвижности. Колонизация развивающегося мозга микроглией происходит на очень ранних этапах эмбриогенеза и предшествует критическим событиям, таким как пики нейрогенеза, астроглиогенеза, олигодендрогенеза и многие другие клеточныепроцессы. Поэтому неудивительно, что микроглия играет важную роль в формировании специфических аспектов развития мозга18, например, посредством регуляции дифференцировки, миграции и выживания нейронов 19,20,21, а также синаптической обрезки5 и миелинизации 22,23,24.
Вклад дисфункциональной микроглии в патогенез и/или прогрессирование нарушений развития нервной системытакже получает все большее признание. Действительно, раннее присутствие микроглии в формирующемся мозге подвергает эти клетки различным физиологическимсостояниям и изменениям окружающей среды. Это может оказать значительное влияние, учитывая, что микроглия является долгоживущими клетками как у грызунов, так и у человека, и сохраняется на протяжении всей жизни за счет самообновления местных предшественников 27,28,29. Мы считаем, что этот протокол может послужить мощным инструментом для лучшей характеристики поведения микроглии в этих различных физиологических состояниях, когда они развиваются, созревают и устанавливают свою сеть на последовательных этапах морфогенеза мозга.
Используя описанную здесь установку, мы успешно визуализировали и получили данные о личинках данио-рерио возрастом до 6 dpf. Распространение анализа на более поздние стадии разработки, скорее всего, увенчается успехом, но потребует корректировки установки визуализации с учетом увеличенного размера выборки, особенно вдоль оси z. При попытке сделать это мы предлагаем сосредоточиться на поддержании низкого соотношения сигнал/шум и быстром времени сканирования, поскольку они являются ключевыми параметрами для успешного анализа.
Мы рекомендуем минимальное время визуализации 1 час для отслеживания микроглии; Самое длинное окно визуализации, которое было протестировано с помощью этого протокола, составляет 8 часов. Кроме того, при анализе слежения важно, чтобы интервал времени между кадрами был как можно короче, в идеале от 30 до 60 секунд. Это позволит получать более точные и подробные данные отслеживания при последующем анализе. Таким образом, особенно при обнаружении более одного флуорофора, принципиально важно избегать наложения спектров спектра и обеспечить достаточное расстояние между двумя спектрами излучения флуорофора, чтобы обеспечить одновременный сбор данных без просвечивания сигнала.
Доступны и другие протоколы для высококачественной покадровой записи мозга рыбок данио-рерио, но это первый, показывающий, как успешно отслеживать все движения микроглии во время эмбрионального развития в течение длительного периода времени. Несмотря на то, что представленный здесь рабочий процесс был сосредоточен на отслеживании микроглии в физиологическом контексте, его можно легко применить к анализу микроглии при патологии. Действительно, у рыбок данио было создано несколько моделей расстройств развития нервной системы, таких как аутизм31, эпилепсия32 и шизофрения33, а также нейродегенерация34 и рак35, которые предоставляют уникальные возможности для определения микроглиальной реакции и поведения при заболеваниях.
Примечательно, что этот протокол отслеживания очень универсален и также может быть полезен для того, чтобы пролить свет на модели миграции различных типов клеток в различных анатомических областях эмбриона данио-рерио, тем самым потенциально открывая возможности для дополнительных применений, выходящих за рамки микроглиальных исследований, описанных в этой статье. Более того, используя возможность комбинировать несколько флуоресцентных трансгенных линий, мы получаем возможность различать пространственные отношения между микроглией и другими типами клеток микроокружения мозга, с возможностью визуализации клеточных взаимодействий и перекрестных помех на протяжении временных записей неинвазивным способом. Это может сыграть важную роль в выяснении физиологического значения поведения микроглии и способствовать более глубокому описанию этих высокоподвижных клеток.
Авторы хотели бы выразить искреннюю благодарность профессору Николасу Байенсу за щедрый доступ к конфокальному микроскопу, необходимому для этого исследования. Эта работа была частично профинансирована Фондами научных исследований (FNRS) в рамках грантов No F451218F и UG03019F, Фондом исследования болезни Альцгеймера (SAO-FRA) (V.W.), A.M. поддерживается исследовательской стипендией FNRS. Рисунок 1 был создан biorender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 L Breeding tanks | Tecniplast | ZB10BTE | |
1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation |
Bottom glass imaging dish | FluoroDish | FD3510-100 | |
Disposable Graduated transfer pipette | avantor | 16001-188 | |
Dry block heater | Novolab | Grant QBD4 | To keep low melting agarose at 37 °C |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
Imaris 10.0 | Oxford Instruments | analysis software | |
Imaris File Converter | Oxford Instruments | https://imaris.oxinst.com/big-data | |
Laser-scanning confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti2-E | |
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140-25G | |
microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50081 | |
Petri dishes (90 mm) | avantor | 391-0559 | |
Pronase | Sigma-Aldrich | 11459643001 | |
Stainless Steel Forceps Dumont No. 5 | FineScienceTools | 11254-20 | |
Stereo microscope | Leica | Leica M80 | To mount the embryos |
teasing needle | avantor | 76549-024 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved