הפרדה מהירה והצגה של חומרים פיברינוגנוליטיים פעילים ב- Sipunculus nudus באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פיברינוגן-פוליאקרילאמיד

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורזה של ג'ל פיברינוגן-פוליאקרילאמיד (PAGE) כדי להפריד במהירות ולהציג את הסוכנים הפיברינוגנוליטיים של Sipunculus nudus.

Abstract

חומרים פיברינוגנוליטיים שיכולים להמיס פיברינוגן ישירות נמצאים בשימוש נרחב בטיפול נוגד קרישה. באופן כללי, זיהוי סוכנים פיברינוגנוליטיים חדשים דורש תחילה הפרדה של כל רכיב ולאחר מכן בדיקת הפעילות הפיברינוגנוליטית שלהם. נכון לעכשיו, אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד (PAGE) וכרומטוגרפיה משמשים בעיקר בשלב ההפרדה. בינתיים, בדיקת צלחת פיברינוגן ומוצרי תגובה מבוססי PAGE מאומצים בדרך כלל כדי להציג את הפעילות הפיברינוגנוליטית שלהם. עם זאת, בגלל ההפרדה המרחבית-זמנית של שני שלבים אלה, אי אפשר להפריד ולהציג את הסוכנים הפיברינוגנוליטיים הפעילים עם אותו ג'ל. כדי לפשט את תהליכי ההפרדה וההצגה של זיהוי סוכנים פיברינוגנוליטיים, בנינו שיטת פיברינוגן-PAGE חדשה כדי להפריד במהירות ולהציג את הסוכנים הפיברינוגנוליטיים של תולעי בוטנים (Sipunculus nudus) במחקר זה. שיטה זו כוללת הכנת פיברינוגן-PAGE, אלקטרופורזה, רנטורה, דגירה, צביעה ודה-קולוריזציה. הפעילות הפיברינוגנוליטית והמשקל המולקולרי של החלבון יכולים להיות מזוהים בו זמנית. על פי שיטה זו, זיהינו בהצלחה יותר מסוכן פיברינוגנוליטי פעיל אחד של תולעת בוטנים בתוך 6 שעות. יתר על כן, שיטת פיברינוגן-PAGE זו היא ידידותית לזמן ועלות. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש לחקר סוכנים פיברינוגנוליטיים של אורגניזמים אחרים.

Introduction

בשנים האחרונות, בשל העלייה המתמשכת של מחלות טרומבוטיות, מחלות טרומבוטיות הפכו לבעיה בריאותית עולמית גדולה חדשה¹. כיום, תרופות antithrombotic מסווגים לשלוש קבוצות: תרופות צבירה טסיות, נוגדי קרישה, ותרופות thrombolytic. ביניהם, תרופות thrombolytic, כגון urokinase (בריטניה), רקמות plasminogen activator (tPA), וכו ', הם התרופות היחידות בשימוש קליני שיכול hydrolyze פקקת². בינתיים, תרופות תרומבוליטיות בטוחות ויעילות יותר מפותחות על ידי זיהוי של סוכנים טרומבוליטיים חדשים³.

עם זאת, הזיהוי של חומרים טרומבוליטיים חדשים הוא גוזל זמן ודורש עבודה, ה....

Protocol

1. הכנת תולעי בוטנים הומוגנט

1. הוסף 50 גרם של תולעי בוטנים ו 150 מ"ל של תמיסת מלח לתוך homogenizer.
2. הומוגניזציה ב 24000 סל"ד במשך 60 שניות.
   הערה: חזור על הפעולה 3 פעמים.
3. צנטריפוגה הומוגנאט ב 9710 x גרם במשך 30 דקות ב 4 °C (75 °F).
4. אספו את הסופרנאטנט כתולעת בוטני.......

Discussion

sFE הוא אנזים פיברינו (גנו) ליטי חדשני שבודד מתולעי בוטנים על ידי הצוות שלנו בעבר 3,6,8,13. עם זאת, תהליכי הזיהוי של sFE היו גוזלים זמן ועבודה, וכללו זיהוי פעילות פיברינוגנוליטית, הפרדת רכיבי חלבונים ושלבי אי?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1  M Tris-HCl (pH 6.8)	Solarbio	T1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)	Solarbio	T1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamide	Biosharp	BL513B
Ammonium persulfate	XiLONG SCIENTIFIC	7727-54-0
Beaker	PYREX	2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solution	Beyotime	P0017F
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Fibrinogen	Solarbio	F8051
Gel loading pipette tips, Bulk	Biosharp	BS-200-GTB
Homogenizer	AHS	ATS-1500
Horizontal rotation oscillator	NuoMi	NMSP-600
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell	BIO-RAD	165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
Pipette Tip (1 mL)	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL)	Axygene	T-10XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (10µL)	Thermo Fisher Scientific	ZX98775
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Pipettor (50 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY15331
Refrigerated Centrifuge	cence	H1650R
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	V900859
Tris	Solarbio	T8060
Tris-HCl	Solarbio	T8230
Triton X-100	Solarbio	T8200