חיזוי ואימות מטרות חלבונים של תרכובת מולקולות קטנות

Summary

הניסוי המשמש כאן מראה שיטה של עגינה מולקולרית בשילוב עם בדיקת שינוי תרמי תאי כדי לחזות ולאמת את האינטראקציה בין מולקולות קטנות למטרות חלבון.

Abstract

חלבונים הם בסיסיים לפיזיולוגיה האנושית, כאשר המטרות שלהם הן קריטיות במחקר ופיתוח תרופות. זיהוי ותיקוף של מטרות חלבון חיוניות הפכו לחלק בלתי נפרד מפיתוח תרופות. עגינה מולקולרית היא כלי חישובי הנמצא בשימוש נרחב כדי לחקור קשירת ליגנד חלבון, במיוחד בהקשר של אינטראקציות מטרה בין תרופות וחלבונים. לצורך אימות ניסיוני של הקשירה וכדי לגשת ישירות לקשירת התרופה ומטרתה, נעשה שימוש בשיטת בדיקת השינוי התרמי התאי (CETSA). מחקר זה נועד לשלב עגינה מולקולרית עם CETSA כדי לחזות ולאמת אינטראקציות בין תרופות ומטרות חלבון חיוניות. באופן ספציפי, חזינו את האינטראקציה בין קסנטטין לחלבון Keap1, כמו גם את מצב הקישור שלו באמצעות ניתוח עגינה מולקולרית, ולאחר מכן אימות של האינטראקציה באמצעות בדיקת CETSA. התוצאות שלנו הראו כי קסנטטין יכול ליצור קשרי מימן עם שאריות חומצות אמינו ספציפיות של חלבון Keap1 ולהפחית את היציבות התרמית של חלבון Keap1, מה שמצביע על כך שקסנטטין יכול לקיים אינטראקציה ישירה עם חלבון Keap1.

Introduction

חלבונים הם מקרומולקולות חשובות ביותר באורגניזמים חיים ויש להם מגוון רחב של פונקציות ייחודיות בתוך התאים, כגון הרכב הממברנה, היווצרות שלד ציטו-שלד, פעילות אנזימים, תחבורה, איתות תאי, ומעורבות במנגנונים תוך-תאיים וחוץ-תאיים ^1,2,3. חלבונים מבטאים את תפקידיהם הביולוגיים בעיקר באמצעות אינטראקציות ספציפיות עם מגוון מולקולות, כולל חלבונים אחרים, חומצות גרעין, ליגנדות של מולקולות קטנות ויוני מתכת ^1,4. ליגנדות הן תרכובות מולקולריות קטנות שנקשרות באופן ספציפי לחלבונים באורגניזם. האינטראקציה בין חלבונים לליגנדות מתרחשת באתרים ספ....

Protocol

1. הורדת המבנים של קסנטטין ו-Keap1

1. פתח את מסד הנתונים PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), הזן xanthatin (מולקולה קטנה), ולאחר מכן לחץ על חיפוש ולחץ על התוצאה הראשונה. לחץ על הורד ולחץ להציל תחת מבנה דו-ממדי כדי לשמור את המתחם בפורמט .sdf.
2. הורד את המבנה הגבי?.......

Discussion

זיהוי מטרות המחלה וגילוי ופיתוח תרופות קשורים קשר הדוק²⁷. על ידי מיקוד מדויק במטרות ספציפיות, ניתן לפתח תרופות מועמדות לטיפול יעיל יותר במחלות מסוימות תוך מזעור תופעות הלוואי הקשורות לתרופות^28,29. המטרות הנפוצות ביותר הן מטרות חלבון³⁰

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm Polyvinylidene fluoride membrane	Millipore	PR05509
Anhydrous ethanol	Chron chemicals	64-17-5
Bovine serum albumin	BioFroxx	4240GR100
Broad-spectrum protease inhibitor mixtures	Boster Biological Technology Co., Ltd	AR1193
DMSO	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0040
Enhanced chemiluminescence reagent	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	P0018S
GAPDH antibody	ProteinTech Group Co., Ltd	10494-1-AP
Gel Imaging Instrument	E-BLOT	Touch Imager Pro
Gradient PCR instrument	Biometra TADVANCED	Biometra Tadvanced 96SG
High-speed freezing centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R
Horseradish peroxidase-conjugated affiniPure goat antibody	ProteinTech Group Co., Ltd	SA00001-2
Isopropyl alcohol	Chron chemicals	67-63-0
Keap1 antibody	Zen BioScience Co., Ltd	R26935
Metal bath	Analytik Jena	TSC
Methanol	Chron chemicals	67-56-1
Ncmblot rapid transfer buffer (20×)	NCM Biotech Co., Ltd	WB4600
Omni-Easy OneStep PAGE gel fast preparation kie	Epizyme Biotech Co., Ltd	PG212
Phosphate buffer saline	Boster Biological Technology Co., Ltd	PYG0021
Prestained Color Protein Marker	Biosharp	BL741A
Protein Blotting Electrophoresis System	Bio-Rad	MiniPROTEANÒTetra Cell
RAW264.7 cell	Beyotime Biotechnology Co., Ltd	C7505
RAW264.7 cell-specific medium	Procell Life Science&Technology Co., Ltd	CM-0597
SDS-PAGE protein loading buffer	Boster Biological Technology Co., Ltd	AR1112-10
SDS-PAGE running buffer powder	Servicebio	G2018
Tris buffered saline powder	Servicebio	G0001
Tween 20	BioFroxx	1247ML100
Water bath	Memmert	WNE10
Water purifier	Millipore	Milli- IQ 7005
Xanthatin	ChemConst Biotechnology Co., Ltd	CONST210706