A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיה תוך-חיונית של הריאה השמאלית של העכבר המושתל באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים. זה מהווה כלי רב ערך לחקר דינמיקה תאית ואינטראקציות בזמן אמת לאחר השתלת ריאות מורין.
סיבוכים לאחר השתלת ריאות קשורים במידה רבה למערכת החיסון המארחת המגיבה לשתל. תגובות חיסוניות כאלה מווסתות על ידי הצלבה בין תאי התורם והמקבל. הבנה טובה יותר של תהליכים אלה מסתמכת על שימוש במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים ונעזרת ביכולת לחקור סחר בתאי מערכת החיסון בזמן אמת. ניתן להשתמש במיקרוסקופ תוך-ויטלי של שני פוטונים כדי לצלם רקמות ואיברים לעומקים של עד כמה מאות מיקרונים עם נזק מינימלי לאור, מה שמקנה יתרון גדול על פני מיקרוסקופ קונפוקלי של פוטון יחיד. שימוש סלקטיבי בעכברים טרנסגניים עם ביטוי חלבון פלואורסצנטי ספציפי למקדם ו / או העברה מאמצת של תאים המסומנים בצבע פלואורסצנטי במהלך מיקרוסקופיה תוך חיונית של שני פוטונים מאפשר מחקר דינמי של תאים בודדים בסביבתם הפיזיולוגית. הקבוצה שלנו פיתחה טכניקה לייצוב ריאות עכברים, שאפשרה לנו לדמיין דינמיקה תאית בריאות נאיביות ושתלי ריאות מושתלים אורתוטופית. טכניקה זו מאפשרת הערכה מפורטת של התנהגות התא בתוך כלי הדם ובאינטרסטיציום, כמו גם לבחינת אינטראקציות בין אוכלוסיות תאים שונות. הליך זה ניתן ללמוד בקלות ולהתאים לחקר מנגנונים חיסוניים המווסתים תגובות דלקתיות וסובלרוגניות לאחר השתלת ריאות. זה יכול גם להיות מורחב לחקר של תנאים ריאתיים פתוגניים אחרים.
השתלת ריאות היא האפשרות האחרונה עבור חולים רבים הסובלים ממחלת ריאות סופנית; עם זאת, הישרדות לטווח ארוך לאחר השתלת ריאות היא גרועה בהשוואה להשתלות איברים מוצקים אחרות. הישרדות בגיל 5 שנים היא רק ~ 60%-70%1, לעומת 80%-90% בלב2 ו 85%-90% בכליות3. סיבוכים רבים לאחר השתלת ריאות, כגון תפקוד לקוי ראשוני של השתל, דחייה בתיווך נוגדנים ותפקוד לקוי כרוני של אלוגרפט ריאה, נובעים מהתגובה החיסונית של המאכסן לאלוגרפט. לדוגמה, הקבוצה שלנו הראתה כי נויטרופילים מגויסים במהירות לתוך אלוגרפט הריאה בעקבות פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה כתוצאה מהשתלה ויוצרים אשכולות דינמיים סביב מונוציטים
כל הליכי הטיפול בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון.
1. הרדמה ואינטובציה
הערה: מבוצעת השתלת ריאה.......
לאחר שעה של אחסון איסכמי קר בטמפרטורה של 4°C, השתלנו אורתוטופית את הריאה השמאלית מעכבר B6 לתוך B6. עכבר LysM-GFP4, ולאחר מכן בוצעה הדמיה תוך חיונית של שני פוטונים, כמתואר לעיל. ביצענו הדמיה בשתי נקודות זמן לאחר ההשתלה – שעתיים (איור 3A) ו-24 שעות (
עירור שני פוטונים תואר לראשונה בעבודת הדוקטורט שלה על ידי מריה גפרט-מאייר בשנת 1931, שזכתה מאוחר יותר בפרס נובל לפיזיקה על תיאור מבנה המעטפת הגרעינית22,23. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מסורתי מסתמך על עירור פוטון יחיד, עם אורכי גל עירור קצרים ובעלי ?.......
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מ-NIH 1P01AI11650 ומהקרן לבית החולים היהודי בארנס. אנו מודים ל-In Vivo Imaging Core בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.75% povidone-iodine | Aplicare | NDC 52380-0126-2 | For disinfectant |
1-inch 20G IV catheter | Terumo | SROX2025CA | For endotracheal tube (ETT) |
1-inch silk tape | Durapore | 3M ID 7100057168 | To secure mouse in position |
20x water immersion long objective lens | Olympus | N20X-PFH | |
3M Vetbond glue | Medi-Vet.com | 10872 | To glue coverglass to lung |
655 nm non-targeted quantum dots | ThermoFisher | Q21021MP | For labeling of blood vessels |
70% ethanol | Sigma Aldrich | EX0281 | For disinfectant |
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen | McKesson | 231 | |
Black O ring (2 cm) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Bolt (2) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Brass thumb nut (2) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Buprenorphine 1.3 mg/mL | Fidelis Animal Health | NDC 86084-100-30 | For pain control |
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser | Coherent | N/A | |
Cover glass (24 mm x 50 mm) | Thomas Scientific | 1202F63 | For custom-built imaging chamber |
Curved mosquito clamp (1) | Fine Science Tools | 13009-12 | |
Dual channel heater controller | Warner Instruments | TC-344B | |
Fine scissors (1) | Fine Science Tools | 15040-11 | |
Fixed-stage upright microscope | Olympus | BX51WI | |
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm) | McKesson | 476709 | To place under left lung |
High vacuum grease | Dow Corning | N/A | To adhere coverglass onto top plate |
Isoflurane 1% | Sigma Aldrich | 26675-46-7 | For anesthesia |
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL | Vedco | NDC 50989-996-06 | For anesthesia |
Metal sheet (3 cm x 7 cm) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Pointed cotton-tipped applicators | Solon | 56225 | To manipulate lung and for blunt dissection |
Power Pro Ultra clipper | Oster | 078400-020-001 | |
Puralube Vet eye ointment | Medi-Vet.com | 11897 | To prevent eye dessiccation |
Small animal ventilator | Harvard Apparatus | 55-0000 | |
Straight forceps (1) | Fine Science Tools | 91113-10 | |
Three channel shutter driver | Uniblitz | VMM-D3 | Resonant scanner |
x.y.z optical stepper motor | Prior Scientific | OptiScan II | |
Xylazine 20 mg/mL | Akorn | NDC 59399-110-20 | For pain control |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved