Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיה תוך-חיונית של הריאה השמאלית של העכבר המושתל באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים. זה מהווה כלי רב ערך לחקר דינמיקה תאית ואינטראקציות בזמן אמת לאחר השתלת ריאות מורין.

Abstract

סיבוכים לאחר השתלת ריאות קשורים במידה רבה למערכת החיסון המארחת המגיבה לשתל. תגובות חיסוניות כאלה מווסתות על ידי הצלבה בין תאי התורם והמקבל. הבנה טובה יותר של תהליכים אלה מסתמכת על שימוש במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים ונעזרת ביכולת לחקור סחר בתאי מערכת החיסון בזמן אמת. ניתן להשתמש במיקרוסקופ תוך-ויטלי של שני פוטונים כדי לצלם רקמות ואיברים לעומקים של עד כמה מאות מיקרונים עם נזק מינימלי לאור, מה שמקנה יתרון גדול על פני מיקרוסקופ קונפוקלי של פוטון יחיד. שימוש סלקטיבי בעכברים טרנסגניים עם ביטוי חלבון פלואורסצנטי ספציפי למקדם ו / או העברה מאמצת של תאים המסומנים בצבע פלואורסצנטי במהלך מיקרוסקופיה תוך חיונית של שני פוטונים מאפשר מחקר דינמי של תאים בודדים בסביבתם הפיזיולוגית. הקבוצה שלנו פיתחה טכניקה לייצוב ריאות עכברים, שאפשרה לנו לדמיין דינמיקה תאית בריאות נאיביות ושתלי ריאות מושתלים אורתוטופית. טכניקה זו מאפשרת הערכה מפורטת של התנהגות התא בתוך כלי הדם ובאינטרסטיציום, כמו גם לבחינת אינטראקציות בין אוכלוסיות תאים שונות. הליך זה ניתן ללמוד בקלות ולהתאים לחקר מנגנונים חיסוניים המווסתים תגובות דלקתיות וסובלרוגניות לאחר השתלת ריאות. זה יכול גם להיות מורחב לחקר של תנאים ריאתיים פתוגניים אחרים.

Introduction

השתלת ריאות היא האפשרות האחרונה עבור חולים רבים הסובלים ממחלת ריאות סופנית; עם זאת, הישרדות לטווח ארוך לאחר השתלת ריאות היא גרועה בהשוואה להשתלות איברים מוצקים אחרות. הישרדות בגיל 5 שנים היא רק ~ 60%-70%1, לעומת 80%-90% בלב2 ו 85%-90% בכליות3. סיבוכים רבים לאחר השתלת ריאות, כגון תפקוד לקוי ראשוני של השתל, דחייה בתיווך נוגדנים ותפקוד לקוי כרוני של אלוגרפט ריאה, נובעים מהתגובה החיסונית של המאכסן לאלוגרפט. לדוגמה, הקבוצה שלנו הראתה כי נויטרופילים מגויסים במהירות לתוך אלוגרפט הריאה בעקבות פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה כתוצאה מהשתלה ויוצרים אשכולות דינמיים סביב מונוציטים

Protocol

כל הליכי הטיפול בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון.

1. הרדמה ואינטובציה

הערה: מבוצעת השתלת ריאה.......

Representative Results

לאחר שעה של אחסון איסכמי קר בטמפרטורה של 4°C, השתלנו אורתוטופית את הריאה השמאלית מעכבר B6 לתוך B6. עכבר LysM-GFP4, ולאחר מכן בוצעה הדמיה תוך חיונית של שני פוטונים, כמתואר לעיל. ביצענו הדמיה בשתי נקודות זמן לאחר ההשתלה – שעתיים (איור 3A) ו-24 שעות (

Discussion

עירור שני פוטונים תואר לראשונה בעבודת הדוקטורט שלה על ידי מריה גפרט-מאייר בשנת 1931, שזכתה מאוחר יותר בפרס נובל לפיזיקה על תיאור מבנה המעטפת הגרעינית22,23. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מסורתי מסתמך על עירור פוטון יחיד, עם אורכי גל עירור קצרים ובעלי ?.......

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מ-NIH 1P01AI11650 ומהקרן לבית החולים היהודי בארנס. אנו מודים ל-In Vivo Imaging Core בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.75% povidone-iodineAplicareNDC 52380-0126-2For disinfectant
1-inch 20G IV catheterTerumoSROX2025CAFor endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tapeDurapore3M ID 7100057168To secure mouse in position
20x water immersion long objective lensOlympusN20X-PFH
3M Vetbond glueMedi-Vet.com10872To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dotsThermoFisherQ21021MPFor labeling of blood vessels
70% ethanolSigma AldrichEX0281For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery PenMcKesson231
Black O ring (2 cm)Hardware storeN/AFor custom-built imaging chamber
Bolt (2)Hardware storeN/AFor custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)Hardware storeN/AFor custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mLFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laserCoherentN/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)Thomas Scientific1202F63For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)Fine Science Tools13009-12
Dual channel heater controllerWarner InstrumentsTC-344B
Fine scissors (1)Fine Science Tools15040-11
Fixed-stage upright microscopeOlympusBX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)McKesson476709To place under left lung
High vacuum greaseDow CorningN/ATo adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%Sigma Aldrich26675-46-7For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)Hardware storeN/AFor custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicatorsSolon56225To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipperOster078400-020-001
Puralube Vet eye ointmentMedi-Vet.com11897To prevent eye dessiccation
Small animal ventilatorHarvard Apparatus55-0000
Straight forceps (1)Fine Science Tools91113-10
Three channel shutter driverUniblitzVMM-D3Resonant scanner
x.y.z optical stepper motorPrior ScientificOptiScan II
Xylazine 20 mg/mLAkornNDC 59399-110-20For pain control

References

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved