מיקרוסקופ תוך-ויטלי דו-פוטוני של ריאת העכבר המושתל

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיה תוך-חיונית של הריאה השמאלית של העכבר המושתל באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים. זה מהווה כלי רב ערך לחקר דינמיקה תאית ואינטראקציות בזמן אמת לאחר השתלת ריאות מורין.

Abstract

סיבוכים לאחר השתלת ריאות קשורים במידה רבה למערכת החיסון המארחת המגיבה לשתל. תגובות חיסוניות כאלה מווסתות על ידי הצלבה בין תאי התורם והמקבל. הבנה טובה יותר של תהליכים אלה מסתמכת על שימוש במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים ונעזרת ביכולת לחקור סחר בתאי מערכת החיסון בזמן אמת. ניתן להשתמש במיקרוסקופ תוך-ויטלי של שני פוטונים כדי לצלם רקמות ואיברים לעומקים של עד כמה מאות מיקרונים עם נזק מינימלי לאור, מה שמקנה יתרון גדול על פני מיקרוסקופ קונפוקלי של פוטון יחיד. שימוש סלקטיבי בעכברים טרנסגניים עם ביטוי חלבון פלואורסצנטי ספציפי למקדם ו / או העברה מאמצת של תאים המסומנים בצבע פלואורסצנטי במהלך מיקרוסקופיה תוך חיונית של שני פוטונים מאפשר מחקר דינמי של תאים בודדים בסביבתם הפיזיולוגית. הקבוצה שלנו פיתחה טכניקה לייצוב ריאות עכברים, שאפשרה לנו לדמיין דינמיקה תאית בריאות נאיביות ושתלי ריאות מושתלים אורתוטופית. טכניקה זו מאפשרת הערכה מפורטת של התנהגות התא בתוך כלי הדם ובאינטרסטיציום, כמו גם לבחינת אינטראקציות בין אוכלוסיות תאים שונות. הליך זה ניתן ללמוד בקלות ולהתאים לחקר מנגנונים חיסוניים המווסתים תגובות דלקתיות וסובלרוגניות לאחר השתלת ריאות. זה יכול גם להיות מורחב לחקר של תנאים ריאתיים פתוגניים אחרים.

Introduction

השתלת ריאות היא האפשרות האחרונה עבור חולים רבים הסובלים ממחלת ריאות סופנית; עם זאת, הישרדות לטווח ארוך לאחר השתלת ריאות היא גרועה בהשוואה להשתלות איברים מוצקים אחרות. הישרדות בגיל 5 שנים היא רק ~ 60%-70%¹, לעומת 80%-90% בלב² ו 85%-90% בכליות³. סיבוכים רבים לאחר השתלת ריאות, כגון תפקוד לקוי ראשוני של השתל, דחייה בתיווך נוגדנים ותפקוד לקוי כרוני של אלוגרפט ריאה, נובעים מהתגובה החיסונית של המאכסן לאלוגרפט. לדוגמה, הקבוצה שלנו הראתה כי נויטרופילים מגויסים במהירות לתוך אלוגרפט הריאה בעקבות פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה כתוצאה מהשתלה ויוצרים אשכולות דינמיים סביב מונוציטים

Protocol

כל הליכי הטיפול בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון.

1. הרדמה ואינטובציה

הערה: מבוצעת השתלת ריאה.......

Discussion

עירור שני פוטונים תואר לראשונה בעבודת הדוקטורט שלה על ידי מריה גפרט-מאייר בשנת 1931, שזכתה מאוחר יותר בפרס נובל לפיזיקה על תיאור מבנה המעטפת הגרעינית^22,23. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מסורתי מסתמך על עירור פוטון יחיד, עם אורכי גל עירור קצרים ובעלי ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control