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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para obter imagens intravitais do pulmão esquerdo de camundongo transplantado usando microscopia de dois fótons. Isso representa uma ferramenta valiosa para estudar a dinâmica e as interações celulares em tempo real após o transplante de pulmão murino.

Abstract

As complicações após o transplante pulmonar estão amplamente relacionadas à resposta do sistema imunológico do hospedeiro ao enxerto. Essas respostas imunes são reguladas por interferência entre células doadoras e receptoras. Uma melhor compreensão desses processos depende do uso de modelos animais pré-clínicos e é auxiliada pela capacidade de estudar o tráfego de células imunes intra-enxerto em tempo real. A microscopia intravital de dois fótons pode ser usada para obter imagens de tecidos e órgãos para profundidades de até várias centenas de mícrons com fotodano mínimo, o que oferece uma grande vantagem sobre a microscopia confocal de fóton único. O uso seletivo de camundongos transgênicos com expressão de proteína fluorescente específica do promotor e/ou transferência adotiva de células marcadas com corante fluorescente durante a microscopia intravital de dois fótons permite o estudo dinâmico de células únicas em seu ambiente fisiológico. Nosso grupo desenvolveu uma técnica para estabilizar pulmões de camundongos, o que nos permitiu obter imagens da dinâmica celular em pulmões virgens e enxertos pulmonares transplantados ortotopicamente. Essa técnica permite uma avaliação detalhada do comportamento celular dentro da vasculatura e no interstício, bem como o exame das interações entre várias populações celulares. Este procedimento pode ser prontamente aprendido e adaptado para estudar os mecanismos imunológicos que regulam as respostas inflamatórias e tolerogênicas após o transplante pulmonar. Também pode ser expandido para o estudo de outras condições pulmonares patogênicas.

Introduction

O transplante de pulmão é a opção final para muitos pacientes que sofrem de doença pulmonar em estágio terminal; no entanto, a sobrevida em longo prazo após o transplante de pulmão é baixa em comparação com outros transplantes de órgãos sólidos. A sobrevida em 5 anos é de apenas ~ 60% -70% 1, em comparação com 80% -90% nos corações2 e 85% -90% nos rins3. Muitas complicações após o transplante pulmonar, como disfunção primária do enxerto, rejeição mediada por anticorpos e disfunção crônica do aloenxerto pulmonar, são devidas à resposta imune do hospedeiro ao aloenx....

Protocol

Todos os procedimentos de manejo de animais foram conduzidos em conformidade com as diretrizes do National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina da Universidade de Washington.

1. Anestesia e intubação

NOTA: O transplante ortotópico de pulmão esquerdo de camundongo é realizado, conforme descrito anteriorment.......

Representative Results

Após 1 h de armazenamento isquêmico frio a 4 °C, transplantamos ortotopicamente o pulmão esquerdo de um camundongo B6 para um B6. LysM-GFP camundongo4 e, em seguida, foi realizada imagem intravital de dois fótons, conforme descrito acima. Realizamos exames de imagem em dois momentos pós-transplante - 2 h (Figura 3A) e 24 h (Figura 3B). Os vasos sanguíneos são marcados em vermelho pelos pontos q in.......

Discussion

A excitação de dois fótons foi descrita pela primeira vez em sua tese de doutorado por Maria Göppert-Mayer em 1931, que mais tarde ganhou o Prêmio Nobel de Física por descrever a estrutura da camada nuclear22,23. A microscopia de fluorescência tradicional depende da excitação de fóton único, com comprimentos de onda de excitação mais curtos e de maior energia do que os comprimentos de onda de emissão. Em contraste c.......

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado por doações do NIH 1P01AI11650 e da Foundation for Barnes-Jewish Hospital. Agradecemos ao In Vivo Imaging Core da Escola de Medicina da Universidade de Washington.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.75% povidone-iodineAplicareNDC 52380-0126-2For disinfectant
1-inch 20G IV catheterTerumoSROX2025CAFor endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tapeDurapore3M ID 7100057168To secure mouse in position
20x water immersion long objective lensOlympusN20X-PFH
3M Vetbond glueMedi-Vet.com10872To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dotsThermoFisherQ21021MPFor labeling of blood vessels
70% ethanolSigma AldrichEX0281For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery PenMcKesson231
Black O ring (2 cm)Hardware storeN/AFor custom-built imaging chamber
Bolt (2)Hardware storeN/AFor custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)Hardware storeN/AFor custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mLFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laserCoherentN/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)Thomas Scientific1202F63For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)Fine Science Tools13009-12
Dual channel heater controllerWarner InstrumentsTC-344B
Fine scissors (1)Fine Science Tools15040-11
Fixed-stage upright microscopeOlympusBX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)McKesson476709To place under left lung
High vacuum greaseDow CorningN/ATo adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%Sigma Aldrich26675-46-7For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)Hardware storeN/AFor custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicatorsSolon56225To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipperOster078400-020-001
Puralube Vet eye ointmentMedi-Vet.com11897To prevent eye dessiccation
Small animal ventilatorHarvard Apparatus55-0000
Straight forceps (1)Fine Science Tools91113-10
Three channel shutter driverUniblitzVMM-D3Resonant scanner
x.y.z optical stepper motorPrior ScientificOptiScan II
Xylazine 20 mg/mLAkornNDC 59399-110-20For pain control

References

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Palavras chave Microscopia de dois f tonsImagem IntravitalTransplante de Pulm oTr fego de C lulas ImunesDin mica CelularIntera es Enxerto HospedeiroEnxerto Pulmonar

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