Microscopia intravital de dois fótons do pulmão de camundongo transplantado

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para obter imagens intravitais do pulmão esquerdo de camundongo transplantado usando microscopia de dois fótons. Isso representa uma ferramenta valiosa para estudar a dinâmica e as interações celulares em tempo real após o transplante de pulmão murino.

Abstract

As complicações após o transplante pulmonar estão amplamente relacionadas à resposta do sistema imunológico do hospedeiro ao enxerto. Essas respostas imunes são reguladas por interferência entre células doadoras e receptoras. Uma melhor compreensão desses processos depende do uso de modelos animais pré-clínicos e é auxiliada pela capacidade de estudar o tráfego de células imunes intra-enxerto em tempo real. A microscopia intravital de dois fótons pode ser usada para obter imagens de tecidos e órgãos para profundidades de até várias centenas de mícrons com fotodano mínimo, o que oferece uma grande vantagem sobre a microscopia confocal de fóton único. O uso seletivo de camundongos transgênicos com expressão de proteína fluorescente específica do promotor e/ou transferência adotiva de células marcadas com corante fluorescente durante a microscopia intravital de dois fótons permite o estudo dinâmico de células únicas em seu ambiente fisiológico. Nosso grupo desenvolveu uma técnica para estabilizar pulmões de camundongos, o que nos permitiu obter imagens da dinâmica celular em pulmões virgens e enxertos pulmonares transplantados ortotopicamente. Essa técnica permite uma avaliação detalhada do comportamento celular dentro da vasculatura e no interstício, bem como o exame das interações entre várias populações celulares. Este procedimento pode ser prontamente aprendido e adaptado para estudar os mecanismos imunológicos que regulam as respostas inflamatórias e tolerogênicas após o transplante pulmonar. Também pode ser expandido para o estudo de outras condições pulmonares patogênicas.

Introduction

O transplante de pulmão é a opção final para muitos pacientes que sofrem de doença pulmonar em estágio terminal; no entanto, a sobrevida em longo prazo após o transplante de pulmão é baixa em comparação com outros transplantes de órgãos sólidos. A sobrevida em 5 anos é de apenas ~ 60% -70% ¹, em comparação com 80% -90% nos corações² e 85% -90% nos rins³. Muitas complicações após o transplante pulmonar, como disfunção primária do enxerto, rejeição mediada por anticorpos e disfunção crônica do aloenxerto pulmonar, são devidas à resposta imune do hospedeiro ao aloenx....

Protocol

Todos os procedimentos de manejo de animais foram conduzidos em conformidade com as diretrizes do National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina da Universidade de Washington.

1. Anestesia e intubação

NOTA: O transplante ortotópico de pulmão esquerdo de camundongo é realizado, conforme descrito anteriorment.......

Discussion

A excitação de dois fótons foi descrita pela primeira vez em sua tese de doutorado por Maria Göppert-Mayer em 1931, que mais tarde ganhou o Prêmio Nobel de Física por descrever a estrutura da camada nuclear^22,23. A microscopia de fluorescência tradicional depende da excitação de fóton único, com comprimentos de onda de excitação mais curtos e de maior energia do que os comprimentos de onda de emissão. Em contraste c.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control