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Aqui, apresentamos um protocolo para obter imagens intravitais do pulmão esquerdo de camundongo transplantado usando microscopia de dois fótons. Isso representa uma ferramenta valiosa para estudar a dinâmica e as interações celulares em tempo real após o transplante de pulmão murino.
As complicações após o transplante pulmonar estão amplamente relacionadas à resposta do sistema imunológico do hospedeiro ao enxerto. Essas respostas imunes são reguladas por interferência entre células doadoras e receptoras. Uma melhor compreensão desses processos depende do uso de modelos animais pré-clínicos e é auxiliada pela capacidade de estudar o tráfego de células imunes intra-enxerto em tempo real. A microscopia intravital de dois fótons pode ser usada para obter imagens de tecidos e órgãos para profundidades de até várias centenas de mícrons com fotodano mínimo, o que oferece uma grande vantagem sobre a microscopia confocal de fóton único. O uso seletivo de camundongos transgênicos com expressão de proteína fluorescente específica do promotor e/ou transferência adotiva de células marcadas com corante fluorescente durante a microscopia intravital de dois fótons permite o estudo dinâmico de células únicas em seu ambiente fisiológico. Nosso grupo desenvolveu uma técnica para estabilizar pulmões de camundongos, o que nos permitiu obter imagens da dinâmica celular em pulmões virgens e enxertos pulmonares transplantados ortotopicamente. Essa técnica permite uma avaliação detalhada do comportamento celular dentro da vasculatura e no interstício, bem como o exame das interações entre várias populações celulares. Este procedimento pode ser prontamente aprendido e adaptado para estudar os mecanismos imunológicos que regulam as respostas inflamatórias e tolerogênicas após o transplante pulmonar. Também pode ser expandido para o estudo de outras condições pulmonares patogênicas.
O transplante de pulmão é a opção final para muitos pacientes que sofrem de doença pulmonar em estágio terminal; no entanto, a sobrevida em longo prazo após o transplante de pulmão é baixa em comparação com outros transplantes de órgãos sólidos. A sobrevida em 5 anos é de apenas ~ 60% -70% 1, em comparação com 80% -90% nos corações2 e 85% -90% nos rins3. Muitas complicações após o transplante pulmonar, como disfunção primária do enxerto, rejeição mediada por anticorpos e disfunção crônica do aloenxerto pulmonar, são devidas à resposta imune do hospedeiro ao aloenx....
Todos os procedimentos de manejo de animais foram conduzidos em conformidade com as diretrizes do National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina da Universidade de Washington.
1. Anestesia e intubação
NOTA: O transplante ortotópico de pulmão esquerdo de camundongo é realizado, conforme descrito anteriorment.......
Após 1 h de armazenamento isquêmico frio a 4 °C, transplantamos ortotopicamente o pulmão esquerdo de um camundongo B6 para um B6. LysM-GFP camundongo4 e, em seguida, foi realizada imagem intravital de dois fótons, conforme descrito acima. Realizamos exames de imagem em dois momentos pós-transplante - 2 h (Figura 3A) e 24 h (Figura 3B). Os vasos sanguíneos são marcados em vermelho pelos pontos q in.......
A excitação de dois fótons foi descrita pela primeira vez em sua tese de doutorado por Maria Göppert-Mayer em 1931, que mais tarde ganhou o Prêmio Nobel de Física por descrever a estrutura da camada nuclear22,23. A microscopia de fluorescência tradicional depende da excitação de fóton único, com comprimentos de onda de excitação mais curtos e de maior energia do que os comprimentos de onda de emissão. Em contraste c.......
Este trabalho é apoiado por doações do NIH 1P01AI11650 e da Foundation for Barnes-Jewish Hospital. Agradecemos ao In Vivo Imaging Core da Escola de Medicina da Universidade de Washington.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.75% povidone-iodine | Aplicare | NDC 52380-0126-2 | For disinfectant |
1-inch 20G IV catheter | Terumo | SROX2025CA | For endotracheal tube (ETT) |
1-inch silk tape | Durapore | 3M ID 7100057168 | To secure mouse in position |
20x water immersion long objective lens | Olympus | N20X-PFH | |
3M Vetbond glue | Medi-Vet.com | 10872 | To glue coverglass to lung |
655 nm non-targeted quantum dots | ThermoFisher | Q21021MP | For labeling of blood vessels |
70% ethanol | Sigma Aldrich | EX0281 | For disinfectant |
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen | McKesson | 231 | |
Black O ring (2 cm) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Bolt (2) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Brass thumb nut (2) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Buprenorphine 1.3 mg/mL | Fidelis Animal Health | NDC 86084-100-30 | For pain control |
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser | Coherent | N/A | |
Cover glass (24 mm x 50 mm) | Thomas Scientific | 1202F63 | For custom-built imaging chamber |
Curved mosquito clamp (1) | Fine Science Tools | 13009-12 | |
Dual channel heater controller | Warner Instruments | TC-344B | |
Fine scissors (1) | Fine Science Tools | 15040-11 | |
Fixed-stage upright microscope | Olympus | BX51WI | |
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm) | McKesson | 476709 | To place under left lung |
High vacuum grease | Dow Corning | N/A | To adhere coverglass onto top plate |
Isoflurane 1% | Sigma Aldrich | 26675-46-7 | For anesthesia |
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL | Vedco | NDC 50989-996-06 | For anesthesia |
Metal sheet (3 cm x 7 cm) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Pointed cotton-tipped applicators | Solon | 56225 | To manipulate lung and for blunt dissection |
Power Pro Ultra clipper | Oster | 078400-020-001 | |
Puralube Vet eye ointment | Medi-Vet.com | 11897 | To prevent eye dessiccation |
Small animal ventilator | Harvard Apparatus | 55-0000 | |
Straight forceps (1) | Fine Science Tools | 91113-10 | |
Three channel shutter driver | Uniblitz | VMM-D3 | Resonant scanner |
x.y.z optical stepper motor | Prior Scientific | OptiScan II | |
Xylazine 20 mg/mL | Akorn | NDC 59399-110-20 | For pain control |
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