Прижизненная двухфотонная микроскопия пересаженного легкого мыши

Summary

В этой статье мы представляем протокол внутрижизненной визуализации трансплантированного левого легкого мыши с помощью двухфотонной микроскопии. Это представляет собой ценный инструмент для изучения клеточной динамики и взаимодействий в режиме реального времени после трансплантации легких мышей.

Abstract

Осложнения после трансплантации легких в значительной степени связаны с реакцией иммунной системы хозяина на трансплантат. Такие иммунные реакции регулируются перекрестными помехами между донорскими и реципиентными клетками. Лучшее понимание этих процессов зависит от использования доклинических моделей на животных и помогает возможность изучать транспортировку иммунных клеток внутри трансплантата в режиме реального времени. Прижизненная двухфотонная микроскопия может быть использована для получения изображений тканей и органов на глубине до нескольких сотен микрон с минимальными фотоповреждениями, что дает большое преимущество перед однофотонной конфокальной микроскопией. Селективное использование трансгенных мышей с экспрессией промотор-специфичных флуоресцентных белков и/или адоптивный перенос флуоресцентных клеток, меченных красителем, во время прижизненной двухфотонной микроскопии позволяет динамически изучать одиночные клетки в их физиологической среде. Наша группа разработала метод стабилизации легких мышей, который позволил нам визуализировать клеточную динамику в наивных легких и ортотопически трансплантированных легочных трансплантатах. Этот метод позволяет детально оценить поведение клеток в сосудистой сети и в интерстиции, а также изучить взаимодействия между различными клеточными популяциями. Эта процедура может быть легко изучена и адаптирована для изучения иммунных механизмов, регулирующих воспалительные и толерогенные реакции после трансплантации легких. Она также может быть расширена до изучения других патогенных легочных заболеваний.

Introduction

Трансплантация легких является последним вариантом для многих пациентов, страдающих терминальной стадией легочной болезни; Тем не менее, долгосрочная выживаемость после трансплантации легких является низкой по сравнению с другими трансплантациями солидных органов. Выживаемость в 5 лет составляет всего ~60%-70%¹, по сравнению с 80%-90% в сердцах² и 85%-90% в почках³. Многие осложнения после трансплантации легких, такие как первичная дисфункция трансплантата, антитело-опосредованное отторжение и хроническая дисфункция аллотрансплантата легкого, обусловлены иммунным ....

Protocol

Все процедуры обращения с животными проводились в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения и использования лабораторных животных и одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию в Медицинской школе Ва?.......

Discussion

Двухфотонное возбуждение было впервые описано в ее докторской диссертации Марией Гёпперт-Майер в 1931 году, которая позже получила Нобелевскую премию по физике за описание структуры ядерной оболочки^22,23. Традиционная флуоресцентная мик?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control