A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
В этой статье мы представляем протокол внутрижизненной визуализации трансплантированного левого легкого мыши с помощью двухфотонной микроскопии. Это представляет собой ценный инструмент для изучения клеточной динамики и взаимодействий в режиме реального времени после трансплантации легких мышей.
Осложнения после трансплантации легких в значительной степени связаны с реакцией иммунной системы хозяина на трансплантат. Такие иммунные реакции регулируются перекрестными помехами между донорскими и реципиентными клетками. Лучшее понимание этих процессов зависит от использования доклинических моделей на животных и помогает возможность изучать транспортировку иммунных клеток внутри трансплантата в режиме реального времени. Прижизненная двухфотонная микроскопия может быть использована для получения изображений тканей и органов на глубине до нескольких сотен микрон с минимальными фотоповреждениями, что дает большое преимущество перед однофотонной конфокальной микроскопией. Селективное использование трансгенных мышей с экспрессией промотор-специфичных флуоресцентных белков и/или адоптивный перенос флуоресцентных клеток, меченных красителем, во время прижизненной двухфотонной микроскопии позволяет динамически изучать одиночные клетки в их физиологической среде. Наша группа разработала метод стабилизации легких мышей, который позволил нам визуализировать клеточную динамику в наивных легких и ортотопически трансплантированных легочных трансплантатах. Этот метод позволяет детально оценить поведение клеток в сосудистой сети и в интерстиции, а также изучить взаимодействия между различными клеточными популяциями. Эта процедура может быть легко изучена и адаптирована для изучения иммунных механизмов, регулирующих воспалительные и толерогенные реакции после трансплантации легких. Она также может быть расширена до изучения других патогенных легочных заболеваний.
Трансплантация легких является последним вариантом для многих пациентов, страдающих терминальной стадией легочной болезни; Тем не менее, долгосрочная выживаемость после трансплантации легких является низкой по сравнению с другими трансплантациями солидных органов. Выживаемость в 5 лет составляет всего ~60%-70%1, по сравнению с 80%-90% в сердцах2 и 85%-90% в почках3. Многие осложнения после трансплантации легких, такие как первичная дисфункция трансплантата, антитело-опосредованное отторжение и хроническая дисфункция аллотрансплантата легкого, обусловлены иммунным ....
Все процедуры обращения с животными проводились в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения и использования лабораторных животных и одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию в Медицинской школе Ва?.......
После 1 ч хранения холодом при температуре 4 °C мы ортотопически пересадили левое легкое от мыши B6 в B6. LysM-GFP мышь4, а затем была проведена прижизненная двухфотонная визуализация, как описано выше. Мы проводили визуализацию в два временных момента после тран?.......
Двухфотонное возбуждение было впервые описано в ее докторской диссертации Марией Гёпперт-Майер в 1931 году, которая позже получила Нобелевскую премию по физике за описание структуры ядерной оболочки22,23. Традиционная флуоресцентная мик?.......
Эта работа поддержана грантами NIH 1P01AI11650 и Фонда Барнс-Еврейской больницы. Мы благодарим Центр визуализации In Vivo в Медицинской школе Вашингтонского университета.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.75% povidone-iodine | Aplicare | NDC 52380-0126-2 | For disinfectant |
1-inch 20G IV catheter | Terumo | SROX2025CA | For endotracheal tube (ETT) |
1-inch silk tape | Durapore | 3M ID 7100057168 | To secure mouse in position |
20x water immersion long objective lens | Olympus | N20X-PFH | |
3M Vetbond glue | Medi-Vet.com | 10872 | To glue coverglass to lung |
655 nm non-targeted quantum dots | ThermoFisher | Q21021MP | For labeling of blood vessels |
70% ethanol | Sigma Aldrich | EX0281 | For disinfectant |
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen | McKesson | 231 | |
Black O ring (2 cm) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Bolt (2) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Brass thumb nut (2) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Buprenorphine 1.3 mg/mL | Fidelis Animal Health | NDC 86084-100-30 | For pain control |
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser | Coherent | N/A | |
Cover glass (24 mm x 50 mm) | Thomas Scientific | 1202F63 | For custom-built imaging chamber |
Curved mosquito clamp (1) | Fine Science Tools | 13009-12 | |
Dual channel heater controller | Warner Instruments | TC-344B | |
Fine scissors (1) | Fine Science Tools | 15040-11 | |
Fixed-stage upright microscope | Olympus | BX51WI | |
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm) | McKesson | 476709 | To place under left lung |
High vacuum grease | Dow Corning | N/A | To adhere coverglass onto top plate |
Isoflurane 1% | Sigma Aldrich | 26675-46-7 | For anesthesia |
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL | Vedco | NDC 50989-996-06 | For anesthesia |
Metal sheet (3 cm x 7 cm) | Hardware store | N/A | For custom-built imaging chamber |
Pointed cotton-tipped applicators | Solon | 56225 | To manipulate lung and for blunt dissection |
Power Pro Ultra clipper | Oster | 078400-020-001 | |
Puralube Vet eye ointment | Medi-Vet.com | 11897 | To prevent eye dessiccation |
Small animal ventilator | Harvard Apparatus | 55-0000 | |
Straight forceps (1) | Fine Science Tools | 91113-10 | |
Three channel shutter driver | Uniblitz | VMM-D3 | Resonant scanner |
x.y.z optical stepper motor | Prior Scientific | OptiScan II | |
Xylazine 20 mg/mL | Akorn | NDC 59399-110-20 | For pain control |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved