Avaliando as medidas de resultados da conectividade da unidade motora do diafragma do rato como biomarcadores quantitativos da degeneração e compensação do neurônio motor frênico

Summary

Neste estudo, apresentamos um método in vivo para estimar o número e o tamanho da unidade motora para quantificar a conectividade da unidade motora do diafragma de ratos. Uma abordagem passo a passo para essas técnicas é descrita.

Abstract

A perda da função muscular ventilatória é uma consequência da lesão do neurônio motor e da neurodegeneração (por exemplo, lesão da medula espinhal cervical e esclerose lateral amiotrófica, respectivamente). Os neurônios motores frênicos são o elo final entre o sistema nervoso central e o músculo, e suas respectivas unidades motoras (grupos de fibras musculares inervadas por um único neurônio motor) representam a menor unidade funcional do sistema ventilatório neuromuscular. O potencial de ação muscular composto (CMAP), o potencial de unidade motora única (SMUP) e a estimativa do número de unidades motoras (MUNE) são abordagens eletrofisiológicas estabelecidas que permitem a avaliação longitudinal da integridade da unidade motora em modelos animais ao longo do tempo, mas têm sido aplicadas principalmente aos músculos dos membros. Portanto, os objetivos deste estudo são descrever uma abordagem em estudos pré-clínicos com roedores que pode ser usada longitudinalmente para quantificar o MUNE frênico, o tamanho da unidade motora (representado como SMUP) e o CMAP e, em seguida, demonstrar a utilidade dessas abordagens em um modelo de perda de neurônios motores. Biomarcadores sensíveis, objetivos e translacionalmente relevantes para lesão neuronal, degeneração e regeneração em lesões e doenças do neurônio motor podem ajudar significativamente e acelerar as descobertas de pesquisas experimentais para testes clínicos.

Introduction

Os neurônios motores frênicos (MNs), estendendo-se dos níveis de miótomo C3 a C6, formam o elo final do sistema nervoso central (SNC) ao músculo diafragma¹. As unidades motoras frênicas (MUs) são compostas por um único MN espinhal e suas fibras musculares diafragmáticas inervadas formando a menor unidade funcional do sistema neuromuscular respiratório. A função ventilatória requer contração adequada do músculo diafragma obtida por meio da ativação coordenada do pool frênico de^MU2,3. Muitas doenças neurológicas, incluindo a esclerose lateral amiotrófica ....

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados e conduzidos em conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Missouri. Os experimentos foram realizados em ratos Sprague-Dawley machos adultos, com idade entre 11 e 15 semanas. Esses ratos foram alojados em pares e mantidos sob um ciclo claro-escuro de 12:12, com acesso a alimentos peletizados comerciais padrão e água tratada com HCl disponível o tempo todo.

Discussion

Nas doenças degenerativas do NM, como a ELA, é crucial avaliar as MUs envolvidas na ventilação²⁸. Apesar da ocorrência de degeneração respiratória do NM em pacientes com ELA, o início específico e a progressão da morte por NM permanecem incompletamente compreendidos 29,30,31. Reconhecendo a importância desse aspecto, vários modelos, tanto de base genética (p.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Glass Syringe	Kent Scientific Corporation	SOMNO-2ML
50 mL, Model 705 RN syringe	Hamilton Company	7637-01	Utilized to conduct intrapleural injection
5008 - Formulab Diet	LabDiet	0001325
Autoclavable 26 G needles (26S RN 9.52 mm 40°)	Hamilton Company	7804-04	Utilized to conduct intrapleural injection
Cholera toxin B-subunit (CTB)	MilliporeSigma	C9903	Utilized for intrapleural injection to label surviving motor neurons
Cholera toxin B-subunit conjugated to saporin (CTB-SAP)	Advanced Targeting Systems	IT-14	Utilized for intrapleural injection to cause motor neuron death
Detachable Cable	Technomed	202845-0000	to connect the recorder electrode to the electrodiagnostic machine
Disposable 2" x 2" disc electrode with leads	Cadwell	302290-000	ground electrode
disposable monopolar needles 28 G	Technomed	202270-000	cathode and anode stimulating electrodes- recording electrodes
EMG needle cable (Amp/stim switch box)	Cadwell	190266-200	to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator
Helping Hands alligator clip with iron base	Radio Shack	64-079	Maintaining recording electrode placement
Isoflurane (250 mL bottle)	Piramal Healthcare
monoject curved tip irrigating syringe	Covidien	81412012	utilized for application of electrode gel
PhysioSuite Physiological Monitoring System with RightTemp Homeothermic Warming	Kent Scientific Corporation	PS-RT	Includes infrared warming pad, rectal probe, and pad temperature probe
Pro trimmer Pet Grooming Kit	Oster	078577-010-003	clippers for hair removal
Saporin (SAP)	Advanced Targeting Systems	PR-01	Utilized for intrapleural injection (control agent when injected by itself)
Sierra Summit EMG system	Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA		portable electrodiagnostic system
SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SOMNO	Includes anti-spill, anti-vapor bottle top adapter; Y adapter tubing; charcoal scavenging filter
Sprague-Dawley rat	Envigo colony 208a, Indianapolis, IN
Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment	Puralube	26870	applied during anesthesia to avoid corneal injury