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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Neste estudo, apresentamos um método in vivo para estimar o número e o tamanho da unidade motora para quantificar a conectividade da unidade motora do diafragma de ratos. Uma abordagem passo a passo para essas técnicas é descrita.

Abstract

A perda da função muscular ventilatória é uma consequência da lesão do neurônio motor e da neurodegeneração (por exemplo, lesão da medula espinhal cervical e esclerose lateral amiotrófica, respectivamente). Os neurônios motores frênicos são o elo final entre o sistema nervoso central e o músculo, e suas respectivas unidades motoras (grupos de fibras musculares inervadas por um único neurônio motor) representam a menor unidade funcional do sistema ventilatório neuromuscular. O potencial de ação muscular composto (CMAP), o potencial de unidade motora única (SMUP) e a estimativa do número de unidades motoras (MUNE) são abordagens eletrofisiológicas estabelecidas que permitem a avaliação longitudinal da integridade da unidade motora em modelos animais ao longo do tempo, mas têm sido aplicadas principalmente aos músculos dos membros. Portanto, os objetivos deste estudo são descrever uma abordagem em estudos pré-clínicos com roedores que pode ser usada longitudinalmente para quantificar o MUNE frênico, o tamanho da unidade motora (representado como SMUP) e o CMAP e, em seguida, demonstrar a utilidade dessas abordagens em um modelo de perda de neurônios motores. Biomarcadores sensíveis, objetivos e translacionalmente relevantes para lesão neuronal, degeneração e regeneração em lesões e doenças do neurônio motor podem ajudar significativamente e acelerar as descobertas de pesquisas experimentais para testes clínicos.

Introduction

Os neurônios motores frênicos (MNs), estendendo-se dos níveis de miótomo C3 a C6, formam o elo final do sistema nervoso central (SNC) ao músculo diafragma1. As unidades motoras frênicas (MUs) são compostas por um único MN espinhal e suas fibras musculares diafragmáticas inervadas formando a menor unidade funcional do sistema neuromuscular respiratório. A função ventilatória requer contração adequada do músculo diafragma obtida por meio da ativação coordenada do pool frênico deMU2,3. Muitas doenças neurológicas, incluindo a esclerose lateral amiotrófica ....

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados e conduzidos em conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Missouri. Os experimentos foram realizados em ratos Sprague-Dawley machos adultos, com idade entre 11 e 15 semanas. Esses ratos foram alojados em pares e mantidos sob um ciclo claro-escuro de 12:12, com acesso a alimentos peletizados comerciais padrão e água tratada com HCl disponível o tempo todo.

Representative Results

As técnicas CMAP, SMUP e MUNE descritas neste relatório permitem o registro da função neuromuscular no músculo diafragma empregando a colocação de eletrodos minimamente invasivos (Figura 1). Os parâmetros de amplitude e área podem ser empregados para caracterizar o tamanho supramáximo do CMAP, fornecendo uma medida global da produção do grupo muscular (Figura 2). No entanto, em nossos métodos atuais, contamos com a .......

Discussion

Nas doenças degenerativas do NM, como a ELA, é crucial avaliar as MUs envolvidas na ventilação28. Apesar da ocorrência de degeneração respiratória do NM em pacientes com ELA, o início específico e a progressão da morte por NM permanecem incompletamente compreendidos 29,30,31. Reconhecendo a importância desse aspecto, vários modelos, tanto de base genética (p.......

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por uma bolsa do Programa de Pesquisa de Lesões/Doenças da Medula Espinhal do Programa de Pesquisa de Lesões/Doenças da Medula Espinhal do Missouri (NLN e WDA).

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL Glass SyringeKent Scientific CorporationSOMNO-2ML
50 mL, Model 705 RN syringeHamilton Company7637-01Utilized to conduct intrapleural injection
5008 - Formulab DietLabDiet0001325
Autoclavable 26 G needles (26S RN 9.52 mm 40°)Hamilton Company7804-04Utilized to conduct intrapleural injection
Cholera toxin B-subunit (CTB)MilliporeSigmaC9903Utilized for intrapleural injection to label surviving motor neurons
Cholera toxin B-subunit conjugated to saporin (CTB-SAP)Advanced Targeting SystemsIT-14Utilized for intrapleural injection to cause motor neuron death
Detachable CableTechnomed202845-0000to connect the recorder electrode to the electrodiagnostic machine
Disposable 2" x 2" disc electrode with leadsCadwell302290-000ground electrode
disposable monopolar needles 28 GTechnomed202270-000cathode and anode stimulating electrodes- recording electrodes
EMG needle cable (Amp/stim switch box)Cadwell190266-200to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator
Helping Hands alligator clip with iron baseRadio Shack64-079Maintaining recording electrode placement 
Isoflurane (250 mL bottle)Piramal Healthcare
monoject curved tip irrigating syringeCovidien81412012utilized for application of electrode gel
PhysioSuite Physiological Monitoring System with RightTemp Homeothermic WarmingKent Scientific CorporationPS-RTIncludes infrared warming pad, rectal probe, and pad temperature probe
Pro trimmer Pet Grooming KitOster078577-010-003clippers for hair removal
Saporin (SAP)Advanced Targeting SystemsPR-01Utilized for intrapleural injection (control agent when injected by itself)
Sierra Summit EMG systemCadwell Industries, Inc., Kennewick, WAportable electrodiagnostic system
SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia SystemKent Scientific CorporationSOMNOIncludes anti-spill, anti-vapor bottle top adapter; Y adapter tubing; charcoal scavenging filter
Sprague-Dawley ratEnvigo colony 208a, Indianapolis, IN
Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment Puralube26870applied during anesthesia to avoid corneal injury

References

  1. Mantilla, C. B., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
  2. Nichols, N. L., Satriotomo, I., Harrigan, D. J., Mitchell, G. S.

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Palavras chave DiafragmaUnidade MotoraNeur nio Motor Fr nicoCMAPSMUPMUNENeuromuscularSistema Ventilat rioBiomarcadoresNeurodegenera oLes o do Neur nio MotorEsclerose Lateral Amiotr ficaLes o da Medula Espinhal

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