הרכבה מודולרית מבוססת CRISPR לבניית ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF

Summary

אנו מציגים פרוטוקול להרכבה מודולרית מבוססת קריספר (CRISPRmass), שיטה לבנייה בתפוקה גבוהה של ספריית פלסמיד UAS-cDNA/ORF בדרוזופילה תוך שימוש במשאבי cDNA/ORF הזמינים לציבור. CRISPRmass ניתן ליישם על עריכת ספריות פלסמיד שונות.

Abstract

בדיקת גנומיקה פונקציונלית מציעה גישה רבת עוצמה לתפקוד גנים ומסתמכת על בניית ספריות פלסמיד רחבות גנום. גישות קונבנציונליות לבניית ספריית פלסמיד גוזלות זמן ומייגעות. לכן, פיתחנו לאחרונה שיטה פשוטה ויעילה, הרכבה מודולרית מבוססת קריספר (CRISPRmass), לבניית תפוקה גבוהה של ספריית פלסמיד במעלה הזרם המפעילה רצף דנ"א משלים/מסגרת קריאה פתוחה (UAS-cDNA/ORF). כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור CRISPRmass, תוך לקיחת כדוגמה את הבנייה של ספריית פלסמיד מבוססת GAL4/UAS UAS-cDNA/ORF. הפרוטוקול כולל תגובות מבחנה דו-שלביות מקבילות באופן מאסיבי ולאחריהן טרנספורמציה חיידקית. השלב הראשון הוא לינאריות של פלסמידים קיימים של DNA משלים (cDNA) או מסגרת קריאה פתוחה (ORF) cDNA או ספריית ORF על ידי חיתוך הרצפים הווקטוריים המשותפים במעלה הזרם הסמוכים לקצה 5' של cDNA או ORFs באמצעות CRISPR/Cas9 יחד עם RNA מנחה יחיד (sgRNA), והשלב השני הוא החדרת מודול UAS לתוך פלסמידים cDNA ליניארי או ORF באמצעות תגובה חד שלבית. CRISPRmass מאפשר בנייה פשוטה, מהירה, יעילה וחסכונית של ספריות פלסמיד שונות. ספריית הפלסמיד UAS-cDNA/ORF יכולה לשמש לבדיקת רווח תפקוד בתאים בתרבית ולבניית ספריית UAS-cDNA/ORF טרנסגנית רחבת גנום בדרוזופילה.

Introduction

סריקה גנטית בלתי משוחדת של גנום שלם היא גישה רבת עוצמה לזיהוי גנים המעורבים בתהליך ביולוגי נתון ולהבהרת המנגנון שלו. לכן, הוא נמצא בשימוש נרחב בתחומים שונים של מחקר ביולוגי. כ-60% מהגנים של דרוזופילה נשמרים בבני אדם ^1,2, ו~75% מהגנים של מחלות אנושיות מכילים הומולוגים בדרוזופילה³. בדיקות סקר גנטיות נחלקות בעיקר לשני סוגים: אובדן תפקוד (LOF) ושיפור תפקוד (GOF). המסכים הגנטיים של LOF בדרוזופילה מילאו תפקיד קריטי בהבהרת מנגנונים השולטים כמעט בכל היבט של הביולוגיה. עם זאת, לרוב הגנים של דרוזופילה אין פנוטיפים ברורים של LOF⁴, ולכן, ב....

Protocol

1. קביעת אתר מחשוף Cas9/sgRNA אופטימלי במעלה הזרם של cDNA/ORF

1. הכנת פלסמידים cDNA או ORF עם עמוד שדרה וקטורי זהה
   1. רכוש שיבוטים של cDNA/ORF הזמינים במשאבים ציבוריים, כגון מרכז המשאבים לגנום דרוזופילה (DGRC, https://dgrc.bio.indiana.edu/) Gold Collection^10,11, אוסף הגנים של יונקים .......

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר של CRISPRmass הם תכנון של sgRNA והערכה של sgRNAs. בחירה של sgRNA יעיל במיוחד עבור Cas9 היא המפתח להצלחה של CRISPRmass. אם מעט מאוד מושבות או בכלל לא נצפות על רוב לוחות LB המכילים אנטיביוטיקה לאחר השינוי של E. coli עם מוצרי הרכבה תגובה בצעד אחד, לבדוק עיכול פלסמיד על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose. אם פ.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Cooling Block	Aikbbio	ADMK-0296	To perform bacterial transformation
DEPC-Treated Water	Invitrogen	AM9906
Gel Extraction Kit	Omega	D2500	To purify DNA from agarose gel
Gel Imaging System	Tanon	2500B
HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit	NEB	E2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621
Plasmid Mini Kit	Omega	D6943	To isolate plasmid DNA from bacterial cells
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0494
S. pyogenes Cas9	GenScript	Z03386
Shaking Incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180V
T series Multi-Block Thermal Cycler	LongGene	T20	To perform PCR
Trans10 Chemically Competent Cell	TranGen BioTech	CD101
Ultraviolet spectrophotometer	Shimadzu	BioSpec-nano	To measure concentration of DNA or RNA