סינתזה ובדיקה של מעכבי חישת מניין Vibrio

Summary

תרכובות Thiophenesulfonamide הן מעכבים חזקים וספציפיים של ויסתי חישת Vibrio quorum LuxR/HapR החוסמים את פעילותם in vivo, ובכך מונעים שעתוק גנים לאלימות, תנועתיות וביופילמים. פרוטוקול זה מפרט כיצד תרכובות אלה מסונתזות, מעוצבות בסיליקו, ונבדקות in vivo לפעילות נגד LuxR/HapR.

Abstract

חיידקים מזהים מספרי אוכלוסייה מקומיים באמצעות חישת מניין, שיטה של תקשורת תא-תא המשמשת באופן נרחב לשליטה בהתנהגויות חיידקים. בזני ויבריו , מווסתי חישת המניין הראשיים LuxR/HapR שולטים במאות גנים לחישת מניין, שרבים מהם משפיעים על אלימות, חילוף חומרים, תנועתיות ועוד. Thiophenesulfonamides הם מעכבים רבי עוצמה של LuxR/HapR הקושרים את כיס הליגנד בגורמי שעתוק אלה וחוסמים את ביטוי הגנים לחישת מניין במורד הזרם. סוג זה של תרכובות שימש כבסיס לפיתוח מערכת של נהלים פשוטים, חזקים וחינוכיים לסטודנטים בקולג' להטמיע את כישורי הכימיה והביולוגיה שלהם באמצעות מודל CURE: ניסיון מחקרי מבוסס קורס לתואר ראשון. פרוטוקולים ממוטבים מתוארים הכוללים שלושה שלבי למידה בפלטפורמה איטרטיבית ורב-תחומית כדי לערב את התלמידים ב- CURE של שנה: (1) לתכנן ולסנתז מעכבי מולקולות קטנות חדשות המבוססים על ליבת thiophenesulfonamide, (2) להשתמש במידול מבני כדי לחזות זיקה קשירה למטרה, ו (3) להעריך את התרכובות ליעילות בבדיקות מיקרוביולוגיות נגד חלבונים ספציפיים Vibrio LuxR/HapR. בדיקת הכתב המתוארת שבוצעה ב- E. coli מנבאת בהצלחה את יעילות התרכובות נגד חלבוני מטרה במיני Vibrio המקומיים.

Introduction

חיידקים חשים את צפיפות האוכלוסייה ואת סוג התאים הסמוכים להם באמצעות תהליך תקשורת תא-תא שנקרא חישת מניין (QS)¹. קבוצות מגוונות של חיידקים משתמשות ב-QS כדי לשלוט בהתנהגויות שונות, כגון תנועתיות, היווצרות ביופילם, הפרשת גורמי אלימות ועוד. החלבונים והאותות המעורבים ב-QS שונים מאוד בין חיידקים. במינים של ויבריו , מערכת האיתות QS משתמשת בעיקר בקולטני היסטידין-קינאז היברידיים הקשורים לממברנה, שמזהים אותות ספציפיים של מולקולות קטנות שנקראים autoinducers² (איור 1). קולטנים אלה שולטים בזרימת הפוספט דרך המערכת לווסת תגובה המתמלל רנ"א קטן. ייצור sRNA משנה את הי....

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. תכנון וסינתזה של ספריות thiophenesulfonamide

הערה: מעכבי Thiophenesulfonamide כגון 3-phenyl-1-(thiophen-2-ylsulfonyl)-1 H-pyrazole (PTSP) מסונתזים באמצעות עיבוי בסיס מקודם שלב^{אחד 8,.......}

Discussion

CURE זה פותח במקור כפרוטוקול מקוצר בן שני שלבים, שלושה שבועות (תכנון/סינתזה ובדיקה) ויושם בחמישה סמסטרים כחלק מקורס מעבדה אורגנית ברמה העליונה⁸. מאז הדו"ח המקורי, מודול המידול הממוחשב נוסף, ואת הבדיקה E. coli היה מותאם עבור חוקרים מתחילים. הפרוטוקול התלת-שלבי,.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract