Síntese e Ensaio de Inibidores de Detecção de Quorum Vibrio

Summary

Os compostos de tiofenesulfonamida são inibidores potentes e específicos dos reguladores de detecção de quorum Vibrio LuxR / HapR que bloqueiam sua atividade in vivo, impedindo assim a transcrição de genes para virulência, motilidade e biofilmes. Este protocolo detalha como esses compostos são sintetizados, modelados in silico e testados in vivo quanto à atividade contra LuxR / HapR.

Abstract

As bactérias detectam números da população local usando quorum sensing, um método de comunicação célula-célula amplamente utilizado para controlar comportamentos bacterianos. Nas espécies de Vibrio , os reguladores mestres de detecção de quorum LuxR / HapR controlam centenas de genes de detecção de quorum, muitos dos quais influenciam a virulência, metabolismo, motilidade e muito mais. As tiofenesulfonamidas são potentes inibidores de LuxR / HapR que se ligam à bolsa do ligante nesses fatores de transcrição e bloqueiam a expressão gênica de detecção de quorum a jusante. Essa classe de compostos serviu de base para o desenvolvimento de um conjunto de procedimentos simples, robustos e educacionais para estudantes universitários assimilarem suas habilidades de química e biologia usando um modelo CURE: experiência de pesquisa de graduação baseada em curso. São descritos protocolos otimizados que compreendem três estágios de aprendizado em uma plataforma iterativa e multidisciplinar para envolver os alunos em uma CURA de um ano: (1) projetar e sintetizar novos inibidores de moléculas pequenas com base no núcleo de tiofenessulfonamida, (2) usar modelagem estrutural para prever a afinidade de ligação ao alvo e (3) testar os compostos quanto à eficácia em ensaios microbiológicos contra proteínas específicas de Vibrio LuxR / HapR. O ensaio repórter descrito realizado em E. coli prevê com sucesso a eficácia dos compostos contra proteínas-alvo nas espécies nativas de Vibrio .

Introduction

As bactérias detectam a densidade populacional e o tipo de células próximas usando um processo de comunicação célula-célula chamado quorum sensing (QS)¹. Diversos clados de bactérias usam QS para controlar vários comportamentos, como motilidade, formação de biofilme, secreção de fator de virulência e muito mais. As proteínas e sinais envolvidos no QS diferem amplamente entre as bactérias. Nas espécies Vibrio , o sistema de sinalização QS usa predominantemente receptores híbridos de histidina-quinase ligados à membrana que reconhecem sinais específicos de pequenas moléculas cognatas chamadas autoindutor....

Protocol

Os detalhes dos reagentes e do equipamento usado para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Desenho e síntese de bibliotecas de tiofenessulfonamida

NOTA: Os inibidores de tiofenesulfonamida, como o 3-fenil-1-(tiofen-2-ilsulfonil)-1H-pirazol (PTSP), são sintetizados por meio da condensação promovida por base de uma etapa ^8,9, confor.......

Discussion

Este CURE foi originalmente desenvolvido como um protocolo abreviado de dois estágios e três semanas (projeto/síntese e ensaio) e foi implementado em cinco semestres como parte de um curso de laboratório orgânico de nível superior⁸. Desde o relatório original, o módulo de modelagem computacional foi adicionado e o ensaio de E. coli foi otimizado para pesquisadores iniciantes. O protocolo resultante de três estágios e dois semestres foi implement.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract