טיהור ואפיון שלפוחיות חוץ-תאיות מתאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן אנושי

Summary

פרוטוקול זה מתאר את כל ההליכים, החל מגידול תאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן אנושי (ADSCs) ואיסוף סופרנאטנט ועד לחילוץ בועיות חוץ-תאיות (EVs) באמצעות אולטרה-צנטריפוגה.

Abstract

תאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן אנושי (ADSCs) יכולים לקדם התחדשות ושחזור של רקמות ואיברים שונים. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שניתן לייחס את תפקודם הרגנרטיבי למגע בין תאים ולהשפעות פרקריניות של תאים. האפקט הפרקריני הוא דרך חשובה לתאים לתקשר ולהעביר מידע למרחקים קצרים, שבהם שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) ממלאות תפקיד פונקציונלי כנשאיות. קיים פוטנציאל משמעותי ל-ADSC EVs ברפואה רגנרטיבית. מחקרים רבים דיווחו על יעילותן של שיטות אלה. כיום מתוארות שיטות שונות לחילוץ ובידוד כלי רכב חשמליים המבוססות על עקרונות כגון צנטריפוגה, משקעים, גודל מולקולרי, זיקה ומיקרופלואידיקה. אולטרה-צנטריפוגה נחשבת לתקן הזהב לבידוד כלי רכב חשמליים. עם זאת, פרוטוקול קפדני להדגשת אמצעי זהירות במהלך אולטרה-צנטריפוגה עדיין נעדר. מחקר זה מציג את המתודולוגיה והצעדים המכריעים הכרוכים בתרבות ADSC, איסוף סופרנאטנטים ואולטרה-צנטריפוגה של כלי רכב חשמליים. עם זאת, למרות שאולטרה-צנטריפוגה היא חסכונית ואינה דורשת טיפול נוסף, עדיין ישנם כמה חסרונות בלתי נמנעים, כגון שיעור התאוששות נמוך וצבירת רכב חשמלי.

Introduction

רוב ADSCs נגזרים מרקמת השומן והוכחו כמקדמים התחדשות ושחזור של רקמות ואיברים שונים, כולל שריר הלב, העצם והעור¹. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שהתפקוד הרגנרטיבי של ADSCs עשוי לנבוע ממגע בין-תאי ומההשפעות הפרקריניות של התאים². האפקט הפרקריני הוא אמצעי חשוב עבור תאים לתקשר ולהעביר מידע על פני מרחקים קצרים, ופונקציה זו מושגת באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs).

כלי רכב חשמליים הם מבני קרום דו-שכבתיים המיוצרים על ידי תאים, בקוטר הנע בין 40 ננומטר ל-160 ננומטר (עם ממוצע של כ-100 ננומטר). הם משפיעים על תפקודים תאיים שונים, כגון ייצור ציטוקינים, התפשטות תאים, אפופטוזיס ומטבוליזם

Protocol

הסקירה הכללית של שלבי הפרוטוקול מוצגת באיור 1. פרטי הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת מדיה

1. הכינו מדיום תרבית עבור ADSC ללא אקסוזומים באמצעות 450 מ"ל של מדיום תרבית בסיסית, 50 מ"ל של נסיוב בקר עוברי ללא אקסוזומים, ו-.......

Discussion

במהלך תהליך הניסוי הפורמלי, מספר נקודות הן קריטיות להשגת תוצאות הניסוי הטובות ביותר. בהתבסס על ניסיון העבר שלנו, מומלץ לבחור במעבר 3-6 ADSCs, מכיוון שהם מבטיחים את מצב התא הטוב ביותר האפשרי. לפני P3, ייתכן שתאי דם אדומים, תאי אנדותל ותאים שונים אחרים לא נבדקו. לאחר P6, התאים עשויים להזדקן בהדרגה, מ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc Needle Filter of Supor Membrane	Acros Organics	4652	0.22 μm
Basal Medium For Cell Culture	OriCell	BHDM-03011
Fetal Bovine Serum Without EXO + Culture Supplement (For Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells)	OriCell	HUXMD-05002
Inverted Microscope	OLYMPUS	Lx70-S8F2
Low Speed Centrifuge	Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.,Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP Tabletop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Penicillin-Streptomycin-Gentamicin Solution (100x)	Solarbio	P1410