A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Этот протокол обеспечивает оптимизированную и сложную процедуру подготовки образцов органоидов сетчатки для просвечивающей электронной микроскопии. Он подходит для приложений, связанных с анализом синапсов в зрелых органоидах сетчатки.
Органоиды сетчатки (РО) представляют собой трехмерную культуральную систему, имитирующую особенности сетчатки человека, которые дифференцировались от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) в определенных условиях. Развитие и созревание синапсов в АФ изучены иммуноцитохимически и функционально. Однако прямые доказательства синаптической контактной ультраструктуры ограничены, содержащей как специальные ленточные синапсы, так и обычные химические синапсы. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) характеризуется высоким разрешением и хорошей историей, выясняющей развитие сетчатки и созревание синапсов у человека и различных видов. Это мощный инструмент для изучения синаптической структуры в РО, который широко используется в области исследований РО. Поэтому для лучшего изучения структуры синаптических контактов RO на наноуровне и получения высококачественных микроскопических доказательств мы разработали простой и воспроизводимый метод подготовки образцов RO TEM. В этой статье описывается протокол, используемые реагенты и подробные шаги, включая подготовку к фиксации ОО, постфиксацию, встраивание и визуализацию.
Сетчатка, жизненно важный орган зрительной чувствительности у человека и млекопитающих, имеет отчетливую слоистую структуру, характеризующуюся тремя ядерными слоями, содержащими нейронные сомы, и двумя плексиформными слоями, образованными синаптическими связями1, включая обычные синапсы и специализированный ленточный синапс 2,3. Ленточный синапс играет решающую роль в передаче импульсов везикул в постепенном порядке 2,3. Процесс зрения включает в себя передачу электрооптического сигнала через ра....
1. Получение RO от iPSCs25
ПРИМЕЧАНИЕ: RO были получены из iPSC путем модификации ранее описанной процедуры.
Создание 3D RO с помощью дифференцировки iPSC является мощным инструментом для изучения механизмов заболевания сетчатки и заместительной терапии стволовыми клетками. Хотя другие продемонстрировали синаптические связи в РО функционально и иммуноцитохимически, прямые ?.......
В этой статье мы представили подробный протокол наблюдения за обычной и ленточной синаптической ультраструктурой в РО с помощью ПЭМ. Этот протокол основан на описанных ранее способах препарирования сетчатки с некоторыми модификациями20. Чтобы повысить ?.......
Эта работа была частично поддержана грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2022YFA1105503), Государственной ключевой лаборатории нейронаук (SKLN-202103) и Чжэцзянского фонда естественных наук Китая (Y21H120019), Фонда естественных наук Китая (82070981).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
Acetone | Electron Microscopy Science | 10000 | |
B27 supplement | Gibco | A3582801 | |
Cell lifter | Santa Cruz | sc-395251 | |
Copper grids | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | AZH400HH | |
DigitalMicrograph Software | Gatan, Inc. | Software | |
Dispase | StemCell Technologies | #07913 | Bacterial protease |
DMEM/F12 medium | Gibco | #11320033 | |
Embedding mold | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | GZ10592 | |
Epon-812 resin | Electron Microscopy Science | #14900 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | #04-0021A | |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16020 | |
hiPSC | Shownin Biotechnology Co. Ltd. | RC01001-A | |
Lead citrate | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | GZ02618 | |
L-GlutaMax | Life Technologies | #35050061 | L-glutamine substitute |
Matrigel | Corning | 356234 | |
Microscope slide | CITOTEST | 80312-3161 | |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | A component of PB/PBS |
NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | A component of PB/PBS |
Non-essential amino acids | Sigma | #M7145 | |
Optical microscope | Lab Binocular Biological Microscope | Xsz-107bnii | |
OsO4 | TED PELLA | 4008-160501 | |
Oven | Bluepard | BPG9040A | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-8 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | #15140-122 | |
Semi/ultrathin microtome | Reichert-Jung | 396649 | |
Taurine | Sigma | #T0625 | |
Toluidine blue | Sangon Biotech | E670105-0100 | |
Transmission Electron Microscopes | HITACHI | H-7500 | |
Uranyl acetate | TED PELLA | CA96049 | |
β-mercaptoethanol | Sigma | 444203 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved