Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Этот протокол обеспечивает оптимизированную и сложную процедуру подготовки образцов органоидов сетчатки для просвечивающей электронной микроскопии. Он подходит для приложений, связанных с анализом синапсов в зрелых органоидах сетчатки.

Abstract

Органоиды сетчатки (РО) представляют собой трехмерную культуральную систему, имитирующую особенности сетчатки человека, которые дифференцировались от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) в определенных условиях. Развитие и созревание синапсов в АФ изучены иммуноцитохимически и функционально. Однако прямые доказательства синаптической контактной ультраструктуры ограничены, содержащей как специальные ленточные синапсы, так и обычные химические синапсы. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) характеризуется высоким разрешением и хорошей историей, выясняющей развитие сетчатки и созревание синапсов у человека и различных видов. Это мощный инструмент для изучения синаптической структуры в РО, который широко используется в области исследований РО. Поэтому для лучшего изучения структуры синаптических контактов RO на наноуровне и получения высококачественных микроскопических доказательств мы разработали простой и воспроизводимый метод подготовки образцов RO TEM. В этой статье описывается протокол, используемые реагенты и подробные шаги, включая подготовку к фиксации ОО, постфиксацию, встраивание и визуализацию.

Introduction

Сетчатка, жизненно важный орган зрительной чувствительности у человека и млекопитающих, имеет отчетливую слоистую структуру, характеризующуюся тремя ядерными слоями, содержащими нейронные сомы, и двумя плексиформными слоями, образованными синаптическими связями1, включая обычные синапсы и специализированный ленточный синапс 2,3. Ленточный синапс играет решающую роль в передаче импульсов везикул в постепенном порядке 2,3. Процесс зрения включает в себя передачу электрооптического сигнала через ра....

Protocol

1. Получение RO от iPSCs25

ПРИМЕЧАНИЕ: RO были получены из iPSC путем модификации ранее описанной процедуры.

  1. Диссоциировать иПСК при слиянии ~90% с помощью бактериальной протеазы (см. Таблицу материалов). Измельчите к?.......

Representative Results

Создание 3D RO с помощью дифференцировки iPSC является мощным инструментом для изучения механизмов заболевания сетчатки и заместительной терапии стволовыми клетками. Хотя другие продемонстрировали синаптические связи в РО функционально и иммуноцитохимически, прямые ?.......

Discussion

В этой статье мы представили подробный протокол наблюдения за обычной и ленточной синаптической ультраструктурой в РО с помощью ПЭМ. Этот протокол основан на описанных ранее способах препарирования сетчатки с некоторыми модификациями20. Чтобы повысить ?.......

Acknowledgements

Эта работа была частично поддержана грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2022YFA1105503), Государственной ключевой лаборатории нейронаук (SKLN-202103) и Чжэцзянского фонда естественных наук Китая (Y21H120019), Фонда естественных наук Китая (82070981).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Petri dishCorning430167
AcetoneElectron Microscopy Science10000
B27 supplementGibcoA3582801
Cell lifterSanta Cruzsc-395251
Copper gridsBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.AZH400HH
DigitalMicrograph SoftwareGatan, Inc.Software
DispaseStemCell Technologies#07913Bacterial protease
DMEM/F12 mediumGibco#11320033
Embedding moldBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GZ10592
Epon-812 resinElectron Microscopy Science#14900
Fetal Bovine Serum (FBS)Biological Industries#04-0021A
GlutaraldehydeElectron Microscopy Science16020
hiPSCShownin Biotechnology Co. Ltd.RC01001-A
Lead citrateBeijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GZ02618
L-GlutaMaxLife Technologies#35050061L-glutamine substitute
MatrigelCorning356234
Microscope slideCITOTEST80312-3161
N2 supplementGibco17502048
Na2HPO4· 12H2OSigma71650A component of PB/PBS
NaH2PO4· H2OSigma71507A component of PB/PBS
Non-essential amino acidsSigma#M7145
Optical microscopeLab Binocular Biological MicroscopeXsz-107bnii
OsO4TED PELLA4008-160501
OvenBluepardBPG9040A
ParaformaldehydeElectron Microscopy Science157-8
Penicillin-StreptomycinGibco#15140-122
Semi/ultrathin microtomeReichert-Jung396649
TaurineSigma#T0625
Toluidine blueSangon BiotechE670105-0100
Transmission Electron MicroscopesHITACHIH-7500
Uranyl acetateTED PELLACA96049
β-mercaptoethanolSigma444203

References

  1. Andreazzoli, M., Barravecchia, I., De Cesari, C., Angeloni, D., Demontis, G. C. Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3d-organoids limitations and bioengineering solutions. Cells. 10 (9), 2489 (2021).
  2. Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F.

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved