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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Nosso protocolo detalhado descreve a criação e o uso do modelo avançado de intestino em chip, que simula a mucosa intestinal humana com estruturas 3D e vários tipos de células, permitindo uma análise aprofundada das respostas imunes e funções celulares em resposta à colonização microbiana.

Abstract

Um modelo avançado de intestino em chip recriando estruturas epiteliais 3D organotípicas semelhantes a vilosidades e criptas foi desenvolvido. O modelo imunocompetente inclui células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), células epiteliais intestinais Caco-2, macrófagos residentes no tecido e células dendríticas, que se auto-organizam dentro do tecido, espelhando características da mucosa intestinal humana. Um aspecto único desta plataforma é sua capacidade de integrar células imunes primárias humanas circulantes, aumentando a relevância fisiológica. O modelo foi projetado para investigar a resposta do sistema imunológico intestinal à colonização e infecção bacteriana e fúngica. Devido ao seu tamanho de cavidade aumentado, o modelo oferece diversas leituras funcionais, como ensaios de permeação, liberação de citocinas e infiltração de células imunes, e é compatível com a medição de imunofluorescência de estruturas 3D formadas pela camada de células epiteliais. Ele fornece informações abrangentes sobre a diferenciação e função celular. A plataforma intestino em chip demonstrou seu potencial na elucidação de interações complexas entre substitutos de uma microbiota viva e tecido hospedeiro humano dentro de uma plataforma de biochip microfisiológico perfundido.

Introduction

Os sistemas Organ-on-Chip (OoC) representam uma técnica emergente de cultura de células 3D que é capaz de preencher a lacuna entre a cultura de células 2D convencional e os modelos animais. As plataformas OoC geralmente consistem em um ou mais compartimentos contendo células específicas do tecido cultivadas em uma ampla variedade de andaimes, como membranas ou hidrogéis1. Os modelos são capazes de mimetizar uma ou mais funções organotípicas definidas. As bombas permitem a perfusão microfluídica contínua do meio de cultura celular para remoção de resíduos celulares, fornecimento de nutrição e fatores de crescimento para melhor diferenciação celu....

Protocol

Este protocolo requer acesso a ~ 20 mL de sangue fresco por biochip de doadores saudáveis para isolar monócitos humanos primários. Todos os doadores assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido para participar deste estudo, que foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital Universitário de Jena (número de permissão 2018-1052-BO). Para obter detalhes sobre os materiais, consulte a Tabela de Materiais. Para obter detalhes sobre a composição de todas as soluções e meios, consulte a

Representative Results

Esses resultados representativos mostram as distintas camadas de tecido do modelo intestino em chip. Eles são corados por imunofluorescência conforme descrito na seção 11 do protocolo. As imagens foram tiradas com um microscópio de epifluorescência ou fluorescência confocal como z-stacks e processadas para uma projeção ortogonal. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre a configuração microscópica e o software. A Figura 5 mostra a camada vascular,.......

Discussion

O protocolo apresentado detalha as etapas necessárias para gerar um modelo de intestino em chip imunocompetente. Descrevemos técnicas específicas e possíveis métodos de leitura, como microscopia de imunofluorescência, análise de citocinas e metabólitos, citometria de fluxo, análise genética e de proteínas e medição de permeabilidade.

O modelo descrito consiste em HUVECs primários, macrófagos derivados de monócitos e células dendríticas derivadas de monócitos co-cultivadas co.......

Acknowledgements

O trabalho foi apoiado financeiramente pelo Centro de Pesquisa Colaborativa PolyTarget 1278 (número do projeto 316213987) para V.D.W. e A.S.M. A.F. e A.S.M. reconhecem ainda o apoio financeiro do Cluster de Excelência "Balance of the Microverse" sob a Estratégia de Excelência da Alemanha - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860. Queremos agradecer a Astrid Tannert e ao Laboratório de Imagem e Biofotônica de Jena (JBIL) por nos fornecer acesso ao seu microscópio confocal de varredura a laser ZEISS LSM980. A Figura 1C e a Figura 2 foram criadas com Biorender.com.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plate black, clear bottomThermo Fisher10000631Consumables
Acetic acidRoth3738.4Chemicals
Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L)Jackson Immuno Research715-545-150Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining
Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Research711-605-152Secondary Antibody Epithelial Staining
Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L)Thermo Fisher Scientific, InvitrogenA31573Secondary Antibody Vascular Staining
Axiocam ERc5s cameraZeiss426540-9901-000Technical equipment
Basal Medium MV, phenol red-freePromocellC-22225Cell culture consumables
BiochipDynamic 42BC002Microfluidic consumables
BSA fraction VGibco15260-037Cell culture consumables
C2BBe1 (clone of Caco-2)ATCCCRL-2102Epithelial Cell Source
ChloroformSigmaC2432Chemicals
CO2 IncubatorHeracell150iTechnical equipment
Collagen IV from human placentaSigma-AldrichC5533Cell culture consumables
Coverslips (24 x 40 mm; #1.5)Menzel-Gläser15747592Consumables
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L)Jackson Immuno Research705-165-147Secondary Antibody Vascular Staining
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L)Jackson Immuno Research712-165-150Secondary Antibody Epithelial Staining
DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dilactate)Thermo Fisher Scientific, InvitrogenD3571Vascular and Epithelial Staining
Descosept PURDr.Schuhmacher00-323-100Cell culture consumables
DMEM high glucoseGibco41965-062Cell culture consumables
DMEM high glucose w/o phenol redGibco31053028Cell culture consumables
DPBS (-/-)Gibco14190-169Cell culture consumables
DPBS (+/+)Gibco14040-133Cell culture consumables
EDTA solutionInvitrogen15575-038Cell culture consumables
Endothelial Cell Growth MediumPromocellC-22020Cell culture consumables
Endothelial Cell Growth Medium supplement mixPromocellC-39225Cell culture consumables
Ethanol 96%, undenaturedNordbrand-Nordhausen410Chemicals
Fetal bovine Seruminvitrogen10270106Cell culture consumables
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa)Sigma AldrichFD4-100MGChemicals
Fluorescent Mounting MediumDakoS3023Chemicals
Gentamycin (10mg/mL)Sigma AldrichG1272Cell culture consumables
GlutaMAX Supplement (100x)Gibco35050061Cell culture consumables
HistopaqueSigma-Aldrich10771Cell culture consumables
Hoechst (bisBenzimid) H33342Sigma-Aldrich14533Epithelial Staining
Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human PlasmaMillipore616397Cell culture consumables
Human recombinant GM-CSFPeprotech300-30Cell culture consumables
Human recombinant M-CSFPeprotech300-25Cell culture consumables
Illumination deviceZeissHXP 120 CFluorescence Microscope Setup
Laser Scanning MicroscopeZeissCLSM980Fluorescence Microscope Setup
Lidocain hydrochlorideSigma-AldrichL5647Cell culture consumables
Lipopolysaccharide (LPS)SigmaL2630Cell culture consumables
Loftex WipesLoftex1250115Consumables
Low attachment tubes (PS, 5 mL)Falcon352052Consumables
Luer adapter for the top cap (M)Mo Bi TecM3003Microfluidic consumables
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaqueMicrofluidic chipshop09-0556-0336-09Microfluidic consumables
MEM Non-Essential Amino Acids SolutionGibco11140Cell culture consumables
MethanolRoth8388.2Chemicals
MicroscopeZeissAxio Observer 5Fluorescence Microscope Setup
Microscope slidesMenzelMZ-0002Consumables
Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1)Thermo Fisher Scientific, Invitrogen14-0688-82Primary Antibody Vascular Staining
Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1)Sigma-Aldrich, MilliporeMABT26Primary Antibody Epithelial Staining
Multiskan Go plate readerThermo Fisher51119300Technical equipment
Normal donkey serumBiozolLIN-END9010-10Chemicals
Optical SectioningZeissApoTomeFluorescence Microscope Setup
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140-122Cell culture consumables
PlugsCole ParmerGZ-45555-56Microfluidic consumables
Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin AntibodyR&D SystemsAF938Primary Antibody Vascular Staining
Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor AntibodyDakoA0082Primary Antibody Vascular Staining
Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibodyThermo Fisher Scientific, Invitrogen61-7300Primary Antibody Epithelial Staining
Power Supply MicroscopeZeissEplax Vp232Fluorescence Microscope Setup
Primovert microscopeZeiss415510-1101-000Technical equipment
Reglo ICC peristaltic pumpIsmatecISM4412Technical equipment
SAHA (Vorinostat)Sigma AldrichSML0061-25MGChemicals
SaponinFluka47036Chemicals
S-Monovette, 7.5 mL Z-GelSarstedt01.1602Consumables
S-Monovette, 9.0 mL K3ESarstedt02.1066.001Consumables
Sodium PyruvateGibco11360-088Cell culture consumables
Tank 4.5 mLChipShop10000079Microfluidic consumables
Trypane blue stain 0.4%InvitrogenT10282Cell culture consumables
TrypsinGibco11538876Cell culture consumables
TubingDynamic 42ST001Microfluidic consumables
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)RothK343.1Consumables
Wheat Germ Agglutinin (WGA)Thermo Fisher Scientific, InvitrogenW32464Epithelial Staining
X-VIVO 15LonzaBE02-060FCell culture consumables, Hematopoietic cell medium
Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterileGreiner Bio-One662 160Consumables
Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterileGreiner Bio-One657 160Consumables
Zen Blue SoftwareZeissVersion 3.7Microscopy Software

References

  1. Alonso-Roman, R., et al. Organ-on-chip models for infectious disease research. Nat Microbiol. 9 (4), 891-904 (2024).
  2. Fahrner, R., Groger, M., Settmacher, U., Mosig, A. S. Functional integration of nat....

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