A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Иммунокомпетентная модель кишечника на чипе для анализа иммунных реакций слизистой оболочки кишечника
* These authors contributed equally
In This Article
Summary
В нашем подробном протоколе описывается создание и использование усовершенствованной модели кишечника на чипе, которая имитирует слизистую оболочку кишечника человека с помощью 3D-структур и различных типов клеток, что позволяет проводить глубокий анализ иммунных реакций и клеточных функций в ответ на микробную колонизацию.
Abstract
Разработана усовершенствованная модель кишечника на чипе, воссоздающая эпителиальные 3D-органотипические структуры, похожие на ворсинки и крипты. Иммунокомпетентная модель включает эндотелиальные клетки пупочных вен человека (HUVEC), эпителиальные клетки кишечника Caco-2, тканевые резидентные макрофаги и дендритные клетки, которые самоорганизуются в ткани, отражая характеристики слизистой оболочки кишечника человека. Уникальным аспектом этой платформы является ее способность интегрировать циркулирующие первичные иммунные клетки человека, повышая физиологическую значимость. Модель предназначена для изучения реакции иммунной системы кишечника на бактериальную и грибковую колонизацию и инфекцию. Благодаря увеличенному размеру полости модель предлагает различные функциональные показания, такие как анализы проникновения, высвобождения цитокинов и инфильтрации иммунных клеток, а также совместима с иммунофлуоресцентным измерением 3D-структур, образованных слоем эпителиальных клеток. Таким образом, он дает всестороннее представление о дифференцировке и функционировании клеток. Платформа «кишечник-на-чипе» продемонстрировала свой потенциал в выяснении сложных взаимодействий между суррогатами живой микробиоты и тканью хозяина человека в рамках платформы микрофизиологических перфузированных биочипов.
Introduction
Системы «орган на чипе» (OoC) представляют собой новую технологию 3D-клеточной культуры, способную преодолеть разрыв между традиционной 2D-культурой клеток и животными моделями. Платформы OoC обычно состоят из одного или нескольких компартментов, содержащих тканеспецифические клетки, выращенные на широком спектре каркасов, таких как мембраны или гидрогели1. Модели способны имитировать одну или несколько определенных органотипических функций. Насосы обеспечивают непрерывную микрофлюидную перфузию среды для клеточных культур для удаления продуктов клеточных отходов, снабжения питательными веществами и факторами роста для улучшения клеточной диффе....
Protocol
Этот протокол требует доступа к ~20 мл свежей крови на биочип от здоровых доноров для выделения первичных моноцитов человека. Все доноры дали письменное информированное согласие на участие в данном исследовании, которое было одобрено комитетом по этике университетской клиники Йены (но?.......
Representative Results
Эти репрезентативные результаты показывают различные слои тканей модели «кишечник-на-чипе». Они окрашены иммунофлуоресцентно, как описано в разделе 11 протокола. Изображения были получены с помощью эпифлуоресцентного или конфокального флуоресцентного микроскопа в виде z-стеков и обр?.......
Discussion
В представленном протоколе подробно описаны необходимые шаги для создания иммунокомпетентной модели кишечника на чипе. Мы описали конкретные методы и возможные методы считывания, такие как иммунофлуоресцентная микроскопия, анализ цитокинов и метаболитов, проточная цитометрия, белк?.......
Disclosures
М.Р. является генеральным директором Dynamic42 GmbH и владеет акциями компании. A.S.M. является научным консультантом компании Dynamic 42 GmbH и владеет акциями компании.
Acknowledgements
Работа была выполнена при финансовой поддержке Центра совместных исследований PolyTarget 1278 (номер проекта 316213987) для V.D.W. и A.S.M. A.F. и A.S.M. также выражают финансовую поддержку со стороны Кластера передового опыта «Баланс микровселенной» в соответствии со стратегией превосходства Германии - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860. Мы выражаем признательность Астрид Таннерт и Йенской лаборатории биофотоники и визуализации (JBIL) за предоставленный нам доступ к их конфокальному лазерному сканирующему микроскопу ZEISS LSM980. Рисунок 1C и рисунок 2 были созданы с помощью Biorender.com.
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate black, clear bottom | Thermo Fisher | 10000631 | Consumables |
| Acetic acid | Roth | 3738.4 | Chemicals |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 715-545-150 | Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 711-605-152 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
| Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A31573 | Secondary Antibody Vascular Staining |
| Axiocam ERc5s camera | Zeiss | 426540-9901-000 | Technical equipment |
| Basal Medium MV, phenol red-free | Promocell | C-22225 | Cell culture consumables |
| Biochip | Dynamic 42 | BC002 | Microfluidic consumables |
| BSA fraction V | Gibco | 15260-037 | Cell culture consumables |
| C2BBe1 (clone of Caco-2) | ATCC | CRL-2102 | Epithelial Cell Source |
| Chloroform | Sigma | C2432 | Chemicals |
| CO2 Incubator | Heracell | 150i | Technical equipment |
| Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | Cell culture consumables |
| Coverslips (24 x 40 mm; #1.5) | Menzel-Gläser | 15747592 | Consumables |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 705-165-147 | Secondary Antibody Vascular Staining |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 712-165-150 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
| DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dilactate) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | D3571 | Vascular and Epithelial Staining |
| Descosept PUR | Dr.Schuhmacher | 00-323-100 | Cell culture consumables |
| DMEM high glucose | Gibco | 41965-062 | Cell culture consumables |
| DMEM high glucose w/o phenol red | Gibco | 31053028 | Cell culture consumables |
| DPBS (-/-) | Gibco | 14190-169 | Cell culture consumables |
| DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | Cell culture consumables |
| EDTA solution | Invitrogen | 15575-038 | Cell culture consumables |
| Endothelial Cell Growth Medium | Promocell | C-22020 | Cell culture consumables |
| Endothelial Cell Growth Medium supplement mix | Promocell | C-39225 | Cell culture consumables |
| Ethanol 96%, undenatured | Nordbrand-Nordhausen | 410 | Chemicals |
| Fetal bovine Serum | invitrogen | 10270106 | Cell culture consumables |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | Chemicals |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | Chemicals |
| Gentamycin (10mg/mL) | Sigma Aldrich | G1272 | Cell culture consumables |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050061 | Cell culture consumables |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | Cell culture consumables |
| Hoechst (bisBenzimid) H33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Epithelial Staining |
| Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human Plasma | Millipore | 616397 | Cell culture consumables |
| Human recombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 | Cell culture consumables |
| Human recombinant M-CSF | Peprotech | 300-25 | Cell culture consumables |
| Illumination device | Zeiss | HXP 120 C | Fluorescence Microscope Setup |
| Laser Scanning Microscope | Zeiss | CLSM980 | Fluorescence Microscope Setup |
| Lidocain hydrochloride | Sigma-Aldrich | L5647 | Cell culture consumables |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630 | Cell culture consumables |
| Loftex Wipes | Loftex | 1250115 | Consumables |
| Low attachment tubes (PS, 5 mL) | Falcon | 352052 | Consumables |
| Luer adapter for the top cap (M) | Mo Bi Tec | M3003 | Microfluidic consumables |
| Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 | Microfluidic consumables |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140 | Cell culture consumables |
| Methanol | Roth | 8388.2 | Chemicals |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer 5 | Fluorescence Microscope Setup |
| Microscope slides | Menzel | MZ-0002 | Consumables |
| Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 14-0688-82 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1) | Sigma-Aldrich, Millipore | MABT26 | Primary Antibody Epithelial Staining |
| Multiskan Go plate reader | Thermo Fisher | 51119300 | Technical equipment |
| Normal donkey serum | Biozol | LIN-END9010-10 | Chemicals |
| Optical Sectioning | Zeiss | ApoTome | Fluorescence Microscope Setup |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Cell culture consumables |
| Plugs | Cole Parmer | GZ-45555-56 | Microfluidic consumables |
| Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin Antibody | R&D Systems | AF938 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor Antibody | Dako | A0082 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 61-7300 | Primary Antibody Epithelial Staining |
| Power Supply Microscope | Zeiss | Eplax Vp232 | Fluorescence Microscope Setup |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1101-000 | Technical equipment |
| Reglo ICC peristaltic pump | Ismatec | ISM4412 | Technical equipment |
| SAHA (Vorinostat) | Sigma Aldrich | SML0061-25MG | Chemicals |
| Saponin | Fluka | 47036 | Chemicals |
| S-Monovette, 7.5 mL Z-Gel | Sarstedt | 01.1602 | Consumables |
| S-Monovette, 9.0 mL K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | Consumables |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-088 | Cell culture consumables |
| Tank 4.5 mL | ChipShop | 10000079 | Microfluidic consumables |
| Trypane blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell culture consumables |
| Trypsin | Gibco | 11538876 | Cell culture consumables |
| Tubing | Dynamic 42 | ST001 | Microfluidic consumables |
| Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | Consumables |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | W32464 | Epithelial Staining |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | Cell culture consumables, Hematopoietic cell medium |
| Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile | Greiner Bio-One | 662 160 | Consumables |
| Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterile | Greiner Bio-One | 657 160 | Consumables |
| Zen Blue Software | Zeiss | Version 3.7 | Microscopy Software |
References
- Alonso-Roman, R., et al. Organ-on-chip models for infectious disease research. Nat Microbiol. 9 (4), 891-904 (2024).
- Fahrner, R., Groger, M., Settmacher, U., Mosig, A. S. Functional integration of nat....
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved