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Este protocolo descreve um método robusto para o desenvolvimento de biofilme de película. O método é escalável para diferentes volumes de cultura, permitindo fácil adoção para vários objetivos experimentais. O desenho do método permite a avaliação qualitativa ou quantitativa do potencial de formação de biofilme de várias espécies de micobactérias.
Muitas bactérias prosperam em comunidades naturais intrincadas, exibindo atributos-chave de multicelularidade, como comunicação, cooperação e competição. A manifestação mais prevalente do comportamento multicelular bacteriano é a formação de biofilmes, muitas vezes ligados à patogenicidade. Os biofilmes oferecem um refúgio contra agentes antimicrobianos, promovendo o surgimento de resistência antimicrobiana. A prática convencional de cultivar bactérias em culturas líquidas de frascos agitados não representa seu crescimento fisiológico adequado na natureza, consequentemente limitando nossa compreensão de sua intrincada dinâmica. Notavelmente, os perfis metabólicos e transcricionais das bactérias que residem em biofilmes se assemelham aos das células em crescimento natural. Esse paralelismo ressalta a importância dos biofilmes como um modelo ideal para pesquisas fundamentais e translacionais. Este artigo se concentra na utilização de Mycobacterium smegmatis como um organismo modelo para ilustrar uma técnica de cultivo de biofilmes de películas. A abordagem é adaptável a vários volumes de cultura, facilitando sua implementação para diversos objetivos experimentais, como estudos antimicrobianos. Além disso, o desenho do método permite a avaliação qualitativa ou quantitativa das capacidades de formação de biofilme de diferentes espécies de micobactérias com pequenos ajustes.
As bactérias são capazes de sobreviver como entidades unicelulares; no entanto, na maioria das condições fisiologicamente relevantes, eles se organizam em miméticos comunitários. O biofilme é uma organização comunitária amplamente reconhecida de bactérias formadas por células agregadas envoltas em uma matriz autoproduzida1. Tal montagem possui assinaturas de multicelularidade precoce e fornece maior resiliência ao estresse para sistemas bacterianos. Os biofilmes são frequentemente tolerantes aos antimicrobianos e estima-se que sejam responsáveis por quase 80% das infecções microbianas
Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos usados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de mídia de Sauton
As películas de biofilme tornam-se visíveis a olho nu a partir do terceiro dia. Embora o biofilme cresça no meio de Sauton sem glicose a 2%, foi observada uma melhora na reticulação quando adicionado. Obtivemos 10,48 mg ± 3,13 mg (n = 4) de peso seco de biofilme de cada poço de uma placa de 24 poços com 1,5 mL de meio de Sauton (suplementado com 2% de glicose) cultivado por quatro dias. Na Figura 2, o desenvolvimento do biofilme foi visível do dia 3.......
O estilo de vida multicelular dos micróbios foi descrito há quase um século; no entanto, os estudos clínicos permanecem escassos, principalmente devido à falta de métodos robustos14. Os métodos descritos em trabalhos sobre biologia de biofilme são muitas vezes difíceis de adaptar. Aqui, espera-se que a metodologia detalhada, auxiliada por demonstrações de etapas críticas, melhore a reprodutibilidade dos protocolos.
O método.......
Este trabalho foi apoiado pela DBT-Ramalingaswami Fellowship concedida a Amitesh Anand.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 µM PVDF syringe filter | Axiva | SFNY04 R | |
1 mL tips | Genetix | GXM-611000 C | |
10 µL tips | Genetix | GXM-6110 C | |
200 µL tips | Genetix | GXM-61200C | |
6-well polypropylene plates | Tarsons | 980010 | |
Amber tubes | Tarsons | 546051 | |
Autoclave | Hospharma | ||
Biosafety Cabinet A II | MSET | ||
Blotting paper | Any suitable vendor | ||
Centrifuge | Eppendorf | ||
Citric acid | Sigma | 251275 | |
Cuvettes | Bio-Rad | 2239955 | |
Ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
Gel documentation system | Bio-Rad | ||
Glass Beads | Sigma | G8772 | |
Glucose | Sigma | 49139 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
Inoculation loops | Genaxy | HS81121C | |
L-Aspargine | Sigma | A0884 | |
LB-agar | Himedia | M1151 | |
LB-media | Himedia | M575 | |
M. smegmatis mc2155 cryo-stock | ATCC | 700084 | |
Magnesium sulfate | Sigma | M2643 | |
Micropipettes | Gilson | ||
Parafilm | Tarsons | ||
Petri Dish | Tarsons | 460020 | |
pH meter | Labman Scientific Instruments | ||
Plate Reader | Tecan | ||
Polypropylene test tubes | Genaxy | GEN-14100-PS | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5379 | |
Rifampicin | MedchemExpress | HY-B0272 | |
Serological pipette | SPL Life Sciences | 95210 | |
Shaker Incubator | Eppendorf | ||
Spatula | |||
Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
Static Incubator | CARON | ||
Sterile 10 mL syringe | Becton Dickinson | 309642 | |
Sterile 50 mL syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
Tween-80 | Sigma | P1754 | |
Weighing balance | Sartorius | ||
Zinc sulfate | Sigma | Z0251 |
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