Crescimento de biofilme micobacteriano como modelo para estudar a resistência antimicrobiana

Summary

Este protocolo descreve um método robusto para o desenvolvimento de biofilme de película. O método é escalável para diferentes volumes de cultura, permitindo fácil adoção para vários objetivos experimentais. O desenho do método permite a avaliação qualitativa ou quantitativa do potencial de formação de biofilme de várias espécies de micobactérias.

Abstract

Muitas bactérias prosperam em comunidades naturais intrincadas, exibindo atributos-chave de multicelularidade, como comunicação, cooperação e competição. A manifestação mais prevalente do comportamento multicelular bacteriano é a formação de biofilmes, muitas vezes ligados à patogenicidade. Os biofilmes oferecem um refúgio contra agentes antimicrobianos, promovendo o surgimento de resistência antimicrobiana. A prática convencional de cultivar bactérias em culturas líquidas de frascos agitados não representa seu crescimento fisiológico adequado na natureza, consequentemente limitando nossa compreensão de sua intrincada dinâmica. Notavelmente, os perfis metabólicos e transcricionais das bactérias que residem em biofilmes se assemelham aos das células em crescimento natural. Esse paralelismo ressalta a importância dos biofilmes como um modelo ideal para pesquisas fundamentais e translacionais. Este artigo se concentra na utilização de Mycobacterium smegmatis como um organismo modelo para ilustrar uma técnica de cultivo de biofilmes de películas. A abordagem é adaptável a vários volumes de cultura, facilitando sua implementação para diversos objetivos experimentais, como estudos antimicrobianos. Além disso, o desenho do método permite a avaliação qualitativa ou quantitativa das capacidades de formação de biofilme de diferentes espécies de micobactérias com pequenos ajustes.

Introduction

As bactérias são capazes de sobreviver como entidades unicelulares; no entanto, na maioria das condições fisiologicamente relevantes, eles se organizam em miméticos comunitários. O biofilme é uma organização comunitária amplamente reconhecida de bactérias formadas por células agregadas envoltas em uma matriz autoproduzida¹. Tal montagem possui assinaturas de multicelularidade precoce e fornece maior resiliência ao estresse para sistemas bacterianos. Os biofilmes são frequentemente tolerantes aos antimicrobianos e estima-se que sejam responsáveis por quase 80% das infecções microbianas

Protocol

Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos usados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de mídia de Sauton

1. Prepare 50 mL de solução de di-hidrogenofosfato de potássio a 2,5% pesando cuidadosamente 1,25 g de di-hidrogenofosfato de potássio e dissolvendo-o em 50 mL de água deionizada.
2. Prepare 50 mL de solução de sulfato de magnésio a 2,5% pesando 2,56 g de sulfat.......

Discussion

O estilo de vida multicelular dos micróbios foi descrito há quase um século; no entanto, os estudos clínicos permanecem escassos, principalmente devido à falta de métodos robustos¹⁴. Os métodos descritos em trabalhos sobre biologia de biofilme são muitas vezes difíceis de adaptar. Aqui, espera-se que a metodologia detalhada, auxiliada por demonstrações de etapas críticas, melhore a reprodutibilidade dos protocolos.

O método.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µM PVDF syringe filter	Axiva	SFNY04 R
1 mL tips	Genetix	GXM-611000 C
10 µL tips	Genetix	GXM-6110 C
200 µL tips	Genetix	GXM-61200C
6-well polypropylene plates	Tarsons	980010
Amber tubes	Tarsons	546051
Autoclave	Hospharma
Biosafety Cabinet A II	MSET
Blotting paper	Any suitable vendor
Centrifuge	Eppendorf
Citric acid	Sigma	251275
Cuvettes	Bio-Rad	2239955
Ferric ammonium citrate	Sigma	F5879
Gel documentation system	Bio-Rad
Glass Beads	Sigma	G8772
Glucose	Sigma	49139
Glycerol	Sigma	G5516
Inoculation loops	Genaxy	HS81121C
L-Aspargine	Sigma	A0884
LB-agar	Himedia	M1151
LB-media	Himedia	M575
M. smegmatis mc2155 cryo-stock	ATCC	700084
Magnesium sulfate	Sigma	M2643
Micropipettes	Gilson
Parafilm	Tarsons
Petri Dish	Tarsons	460020
pH meter	Labman Scientific Instruments
Plate Reader	Tecan
Polypropylene test tubes	Genaxy	GEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5379
Rifampicin	MedchemExpress	HY-B0272
Serological pipette	SPL Life Sciences	95210
Shaker Incubator	Eppendorf
Spatula
Spectrophotometer	Thermo Scientific
Static Incubator	CARON
Sterile 10 mL syringe	Becton Dickinson	309642
Sterile 50 mL syringe	Becton Dickinson	309653
Tween-80	Sigma	P1754
Weighing balance	Sartorius
Zinc sulfate	Sigma	Z0251