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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo descreve um método robusto para o desenvolvimento de biofilme de película. O método é escalável para diferentes volumes de cultura, permitindo fácil adoção para vários objetivos experimentais. O desenho do método permite a avaliação qualitativa ou quantitativa do potencial de formação de biofilme de várias espécies de micobactérias.

Abstract

Muitas bactérias prosperam em comunidades naturais intrincadas, exibindo atributos-chave de multicelularidade, como comunicação, cooperação e competição. A manifestação mais prevalente do comportamento multicelular bacteriano é a formação de biofilmes, muitas vezes ligados à patogenicidade. Os biofilmes oferecem um refúgio contra agentes antimicrobianos, promovendo o surgimento de resistência antimicrobiana. A prática convencional de cultivar bactérias em culturas líquidas de frascos agitados não representa seu crescimento fisiológico adequado na natureza, consequentemente limitando nossa compreensão de sua intrincada dinâmica. Notavelmente, os perfis metabólicos e transcricionais das bactérias que residem em biofilmes se assemelham aos das células em crescimento natural. Esse paralelismo ressalta a importância dos biofilmes como um modelo ideal para pesquisas fundamentais e translacionais. Este artigo se concentra na utilização de Mycobacterium smegmatis como um organismo modelo para ilustrar uma técnica de cultivo de biofilmes de películas. A abordagem é adaptável a vários volumes de cultura, facilitando sua implementação para diversos objetivos experimentais, como estudos antimicrobianos. Além disso, o desenho do método permite a avaliação qualitativa ou quantitativa das capacidades de formação de biofilme de diferentes espécies de micobactérias com pequenos ajustes.

Introduction

As bactérias são capazes de sobreviver como entidades unicelulares; no entanto, na maioria das condições fisiologicamente relevantes, eles se organizam em miméticos comunitários. O biofilme é uma organização comunitária amplamente reconhecida de bactérias formadas por células agregadas envoltas em uma matriz autoproduzida1. Tal montagem possui assinaturas de multicelularidade precoce e fornece maior resiliência ao estresse para sistemas bacterianos. Os biofilmes são frequentemente tolerantes aos antimicrobianos e estima-se que sejam responsáveis por quase 80% das infecções microbianas

Protocol

Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos usados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de mídia de Sauton

  1. Prepare 50 mL de solução de di-hidrogenofosfato de potássio a 2,5% pesando cuidadosamente 1,25 g de di-hidrogenofosfato de potássio e dissolvendo-o em 50 mL de água deionizada.
  2. Prepare 50 mL de solução de sulfato de magnésio a 2,5% pesando 2,56 g de sulfat.......

Representative Results

As películas de biofilme tornam-se visíveis a olho nu a partir do terceiro dia. Embora o biofilme cresça no meio de Sauton sem glicose a 2%, foi observada uma melhora na reticulação quando adicionado. Obtivemos 10,48 mg ± 3,13 mg (n = 4) de peso seco de biofilme de cada poço de uma placa de 24 poços com 1,5 mL de meio de Sauton (suplementado com 2% de glicose) cultivado por quatro dias. Na Figura 2, o desenvolvimento do biofilme foi visível do dia 3.......

Discussion

O estilo de vida multicelular dos micróbios foi descrito há quase um século; no entanto, os estudos clínicos permanecem escassos, principalmente devido à falta de métodos robustos14. Os métodos descritos em trabalhos sobre biologia de biofilme são muitas vezes difíceis de adaptar. Aqui, espera-se que a metodologia detalhada, auxiliada por demonstrações de etapas críticas, melhore a reprodutibilidade dos protocolos.

O método.......

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela DBT-Ramalingaswami Fellowship concedida a Amitesh Anand.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µM PVDF syringe filterAxivaSFNY04 R
1 mL tipsGenetixGXM-611000 C
10 µL tipsGenetixGXM-6110 C
200 µL tipsGenetixGXM-61200C
6-well polypropylene platesTarsons980010
Amber tubesTarsons546051
AutoclaveHospharma
Biosafety Cabinet A IIMSET
Blotting paperAny suitable vendor
CentrifugeEppendorf
Citric acidSigma251275
CuvettesBio-Rad2239955
Ferric ammonium citrateSigmaF5879
Gel documentation systemBio-Rad
Glass BeadsSigmaG8772
GlucoseSigma49139
GlycerolSigmaG5516
Inoculation loopsGenaxyHS81121C
L-AspargineSigmaA0884
LB-agarHimediaM1151
LB-mediaHimediaM575
M. smegmatis mc2155 cryo-stockATCC700084
Magnesium sulfateSigmaM2643
MicropipettesGilson
ParafilmTarsons
Petri DishTarsons460020
pH meterLabman Scientific Instruments
Plate ReaderTecan
Polypropylene test tubesGenaxyGEN-14100-PS
Potassium phosphate monobasicSigmaP5379
RifampicinMedchemExpressHY-B0272
Serological pipetteSPL Life Sciences95210
Shaker IncubatorEppendorf
Spatula
SpectrophotometerThermo Scientific
Static IncubatorCARON
Sterile 10 mL syringeBecton Dickinson309642
Sterile 50 mL syringeBecton Dickinson309653
Tween-80SigmaP1754
Weighing balanceSartorius
Zinc sulfateSigmaZ0251

References

  1. Davey, M. E., O'toole, G. A. Microbial biofilms: From ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).
  2. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nat Rev Microbiol. 18 (10), 571-586 (2020).
  3. ....

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